抗人骨髓间充质干细胞单抗(ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10)与SH2单抗的应用比较

廖志雄 沈建根 楼正青

(1.杭州市中医院,浙江 杭州 310007;2.浙江大学医学院,浙江 杭州 310031)

人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)是存在于骨髓中具有高度自我更新和多向分化潜能的干细胞群体,在组织工程、细胞移植等领域中应用前景十分广阔,目前已成为干细胞研究领域的一个热点[1]。迄今,国内外还没有类似于CD34识别造血干细胞一样的标记物用于鉴定hMSCs[2]。为了探索分离和鉴定hMSCs的新途径,作者以多供体hMSCs为抗原,制备了4株抗hMSCs单克隆抗体,并对其生特学特性进行了研究。本文将对所制单抗与SH2(进口单抗)在hMSCs的检测与分选等各方面进行比较,探讨所制单抗的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 自制抗hMSCs单抗杂交瘤细胞株ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10,亲和层 析柱及 SPA-sepharose CL-4B凝胶(Pharmacia公司),流式细胞仪(Becton Dickinson公司),SH2杂交瘤细胞株(ATCC 公司,美国,编号:HB10743),组织标本(肌肉 、骨髓、神经 、胆囊 、皮肤、肝、肺 、包 皮、肌腱 、脂肪、韧带、动脉)由浙江大学医学院血液学研究所提供,RPMI-1640为日本制药株式会社产品,Ficollpaque分离液购自上海试剂二厂,胎牛血清、LGDMEM培养液购自GIBCO BRL公司,羊抗小鼠IgG+IgM-FITC为ALTAG公司产品,辣根过氧化物酶(Strepavidin-HRP)免疫组化染色超敏试剂盒为福州迈新生物技术开发公司产品,小牛血清(超级)购自杭州四季青生物工程材料研究所,羊抗小鼠IgG磁珠二抗购自Miltenyi Biotec公司。

1.2 方法

1.2.1 抗hMSCs单抗的制备与纯化 以多供体hMSCs免疫BALB/C小鼠,制得4株抗hMSCs单抗(分别命名为 ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10),将 4 株单抗杂交瘤细胞及SH2杂交瘤细胞复苏扩增后,接种至液体石蜡预处理过的BALB/C小鼠腹腔,10～15天后收集腹水,所得腹水经盐析后以离子交换柱纯化或亲和层析纯化[3]。

1.2.2 流式细胞术检测 (1)骨髓单个核细胞的分离从健康骨髓捐赠者抽取10mL骨髓,以Ficollpaque(比重1.077±0.001)淋巴细胞分离液密度梯度离心获得骨髓单个核细胞;(2)单个核细胞用PBS液洗2次,细胞重悬于含10%胎牛血清的LGDMEM 培养液,按2.0×106密度接种于T-25cm2培养瓶,置5%CO2、37℃孵育培养,48小时后更换培养液,弃去非贴壁细胞,以后3～4天换液1次,贴壁细胞约80%～90%,融合后用 0.25%胰酶1mmol/L EDTA消化,按1:2传代培养;(3)流式细胞仪检测收集分离培养的hMSCs,重悬至1×107/mL,各取0.1mL/管加入1∶50稀释的 5种单抗(ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10及SH2)0.1mL,以 PBS作为阴性对照,室温孵育1小时,离心洗涤后重悬至0.1mL,加入羊抗小鼠IgG+IgM-FITC,室温孵育1小时后离心洗涤,重悬后流式细胞仪检测[4]。

1.2.3 特异性检测 采用免疫组织化学法进行,共十二种人源组织(肌肉、骨髓、神经、胆囊、皮肤、肝 、肺 、包皮 、肌腱 、脂肪 、韧带 、动脉)切片 ,经二甲苯Ⅰ5分钟、二甲苯Ⅱ5分钟、无水酒精Ⅰ 30秒、无水酒精Ⅱ 30秒、95%酒精Ⅰ30秒、95%酒精Ⅱ30秒、90%酒精30秒、80%酒精30秒、70%酒精 30秒、自来水洗、0.3%H2O2甲醇处理切片15分钟、水洗、抗原修复、PBS洗 3次、加血清孵育 20分钟、甩干血清 、加入 一抗(ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10 及SH2,1∶105)80μ L 60分钟,PBS洗 3次(每次 2 分钟)、加入ABC复合物、孵育30分钟、PBS洗3次(每次2分钟)、DAB-H2O2孵育 10分钟、PBS洗及水洗、Harris苏木素核染 10分钟、水洗、分化、蓝化、脱水、透明、中性树胶封片、观察结果。

1.2.4 hMSCs分选及分选阳性细胞表型分析 采用正向免疫磁珠分选法对hMSCs进行分选:采集健康供者骨髓,以密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞(方法同上),用自制单克隆抗体与骨髓单个核细胞孵育,离心洗涤后加羊抗小鼠IgG磁珠二抗孵育,离心洗涤后通过免疫磁珠分选系统从骨髓单个核细胞中分离与单克隆抗体标记的阳性细胞,将阳性细胞于培养皿培养,用含10%(V/V)胎牛血清的低糖DMEM培养液,置于37℃、5%CO2培养箱培养,每隔3天换液1次,将培养的hMSCs消化后以生理盐水悬浮后加入到eppendorf管中,每管100μ L,加单克隆抗体100μ L(1∶100)室温孵育 2小时,4000rpm/min离心5分钟,弃上清,以0.01 mol/L pH7.2 PBS 3%FCS洗3次,100μ L PBS悬浮,加入荧光标记的二抗3μ L,小牛血清 100μ L,室温避光 1小时,同上洗3次,400μ L PBS悬浮,用流式细胞仪分析阳性细胞表面分子的表型,所用单抗有 CD14、CD29、CD34、CD44、CD45、CD105、CD166、HLA-DR 等 。

1.3 统计学处理 数据采用SPSS13.0统计软件,两组均数间比较用t检验。

2 结 果

2.1 成功获得纯化后的高纯度腹水单抗(ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10及 SH2)。

2.2 流式细胞仪检测 以ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10及SH2为探针,用流式细胞仪检测了分离培养的hMSCs阳性表达率,从图1可知,分离培养的hMSCs阳性表达率分别为 ZUB1:96.98%、ZUB4:98.99%、ZUC3:96.55、ZUF10:98.91%,皆高于 SH2的 86.07%,SH2 与 ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10 的阳性率比较具有显著性差异(P＜0.05)。

图1 5个抗hMSCs单克隆抗体对分离培养的hMSCs表达结果(N为阴性对照)

2.3 特异性检测 用间接免疫荧光法将自制4个单克隆抗体以免疫组织化学法检测了间充质和非间充质来源的组织标本,结果ZUB1、ZUB4、ZUC3、ZUF10对被检的12种组织标本中仅对骨髓有交叉反应,其余11种均无交叉反应(表1),表明4个单克隆抗体对hMSCs具有较高特异性。

表1 抗MSCs单克隆抗体与不同来源组织标本的反应

2.4 正向免疫磁珠分选法分选hMSCs 分选阳性细胞表型特征:经流式细胞术测定,分选后的第一代和第五代细胞表型为:CD29+、CD44+、CD166+、CD105+及 CD14-、CD34-、CD45-及 HLA-DR-,提示所分选阳性细胞中无明显造血干细胞污染。

3 讨 论

hMSCs是一种能够自我更新和分化为多种间叶组织的干细胞,至今还没有公认的类似于CD34识别造血干细胞的抗体用于确认hMSCs。当今在hMSCs检测及应用方面较为广泛使用的单抗主要有SH2、SH3、SH4、Stro-1 等,其中最为常用的是 SH2。由于以上单抗针对hMSCs的特异性有限,如SH2与非间充质来源的小肠、肺及肝等细胞存在交叉反应;SH3、SH4则据文献报道能与间充质来源的骨膜细胞、软骨细胞及非间充质来源的肝、胆囊等存在交叉反应,限制了它们在hMSCs的检测、分选及鉴定等方面的应用[5-6]。

作者用多供体hMSCs免疫BALB/C小鼠,制备了4株抗hMSCs单克隆抗体,对单抗的特异性进行了检测,结果显示所制4株单抗对多种组织(间充质与非间充质来源)不存在交叉反应,而SH2则对骨髓、小肠、肺及肝存在交叉反应,所制4株单抗针对hMSCs的特异性高于SH2,在FACS检测中,以自制4株抗hMSCs单抗及SH2单抗为探针,检测了分离培养的hMSCs,其阳性表达率分别为:ZUB1:96.98%、ZUB4:98.99%、ZUC3:96.55、ZUF10:98.91%,SH2:86.07%。结果显示4个抗hMSCs单抗在hMSCs上的阳性表达率皆高于SH2。

将所制单抗应用于hMSCs的免疫磁珠分选,分选出的阳性细胞具有典型的hMSCs表型,分选后的阳性细胞中存在少量悬浮细胞(＜1%),可能是死亡的hMSCs,也可能为其它杂细胞。

以上实验说明作者自制的4个抗hMSCs单抗不仅在针对hMSCs的特异性上优于SH2,而且在hMSCs上的阳性表达率都高于SH2,具有高度的特异性和敏感性。4个抗hMSCs单抗在hMSCs鉴定与分选方面具有很高的应用价值。目前hMSCs研究多从国外购买SH2单抗或SH2杂交瘤细胞株,不仅耗时、费用高,且特异性不理想,作者自制的抗hMSCs单抗为hMSCs的研究提供了应用价值高、费用低廉的新的实验工具。

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[5] Brenton S,Nathalie B,Teresa O S,et al.Mesenchyman stem cells.Archives of Medical Research,2010,34(6):565

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