银屑病基因差异化表达研究

杨积顺 徐立平

(解放军第100医院药械科，215007)

银屑病是常见的慢性复发性皮肤病，其发病机制仍不清楚。基因芯片，又称基因微阵列，是将大量的靶基因DNA片段以及不同长度的寡核苷酸高密度、有序地排列在硅片及合金片等固相物质上。该技术已广泛应用于基因表达图谱分析、肿瘤分子分型、基因诊断、基因突变、新药研发等方面，且具有背景噪音低、重复性好、系统误差小等优点。银屑病发病机制中的重要相关基因还有待进一步的明确，因此，本研究采用现代基因芯片技术，通过使用随机方差模型，筛选出银屑病病人及健康人皮肤中显著性差异基因，试为揭示银屑病发病机制及药物研究提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 皮肤组织来源 银屑病病人皮损组织3例，来源于皮肤科门诊，年龄(32.25±4.36)岁，部位为病人腹部皮肤；健康人皮肤组织3例，来源于医院整形科门诊，年龄(37.34±4.16)岁，取材部位为腹部皮肤。银屑病皮肤样本由病理科组织病理学确认，3例银屑病病人入组前均未患其他皮肤性疾病，且未进行过局部或系统性药物治疗。所有参加本研究的志愿者均签署知情同意书。

1.2 试剂 总RNA抽提采用Invitrogen公司的试剂盒；无RNA酶的糖原(Invitrogen公司)；cRNA标记与合成采用TrueLabeling-AMPTM线性RNA扩增试剂盒和SuperArray Array-Grade cRNA 纯 化 试 剂 盒(货 号 ：GA-012)；Biotin-16-dUTP(Roche Cat.No.1-093-070)；GEAhyb杂交液 (SuperArray Bioscience)；化学发光检测试剂盒Chemiluminescent Detection Kit(SuperArray Bioscience，Catalog Number D-01)，异丙醇、氯仿、无水乙醇等均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 总RNA的提取 以健康组皮肤样本为对照，每100 mg银屑病组与健康组皮肤样品，采用Invitrogen公司的TRIZOL试剂一步法抽提皮肤样品的总RNA，取少量液体用TE(10 mM Tris-HCl pH 8，1 mM EDTA)稀释(1∶100稀释)后，采用紫外吸收测定方法，读取其在分光光度计260 nm和280 nm处的吸收值，采用变性琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的条带，定量分析检测RNA的质量，A260/A280在1.8～2.0之间，且前者的条带约是后者条带的2倍。

1.3.2 Affmetrix表达谱芯片实验与数据分析 芯片的杂交在Oligo GEArray芯片杂交管中进行，采用预热GEAhyb杂交液对生物素标记的cRNA样品进行预杂交和杂交。芯片的化学发光检测按照SuperArray公司提供的化学发光检测试剂盒操作步骤进行。通过X胶片和台式扫描仪获得芯片图像采集。使用综合型GEArray表达分析配套软件进行完整的芯片数据分析，从而获得银屑病组和健康组的差异基因。同时进行生物信息学分析，获得每条基因的名称及其基本生物学信息。利用Cluster 3.0软件进行聚类分析。

2 结果

2.1 一般情况 将病理组织确认为银屑病的皮损，同时按照RNA质量标准，将RNA质量合格者纳入基因芯片实验。

2.2 银屑病基因表达差异(表1) Ratio值分析：对银屑病组和正常对照组芯片中每张芯片上的所有基因的比值Ratio进行分析，得出银屑病组和正常组间存在差异表达基因共105条。其中表达上调(Ratio值大于2)的有47条，表达水平下调(Ratio值小于0.5)的有58条。经检索基因表达公共数据库，获得每条基因的名称和其他基本信息表，其中表达上调幅度最大的基因为ABCC1，表1中列出若干银屑病差异表达基因。

表1 银屑病差异基因表达

3 讨论

随着对银屑病发病机制认识的不断深入，我们对银屑病的认识较过去有了长足的进步，但至今仍不知道银屑病发病机制中涉及的重要功能基因是如何发挥功能的，或者说它们是如何按照特定的时间、空间进行基因表达的，表达的量是多少，基因之间的调控关系是怎么样。基因芯片是在核酸层次上研究基因表达的最新技术之一，可以大规模的对基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段的特异性、分化阶段特异性、疾病特异性等进行综合分析和判断，基因芯片技术的出现，对极其复杂的生命现象及疾病研究提供了一种高通量、大规模、高度并行性、快速高效、高度灵敏、蕴藏高价值以及高度自动化的方法。银屑病发病病因复杂，通过基因芯片技术挖掘到有趣的靶基因以及银屑病的易感性基因位点，对更好地了解银屑病的复杂的病因，发现新的银屑病的治疗靶点提供捷径。Mee JB等[1]利用基因芯片技术，发现银屑病与IL-1转录因子密切相关。本研究中ABCC1基因在银屑病中表达上调，可能与银屑病发病机制密切相关，其为ATP结合盒(ABC)药物转运蛋白。ABCC1是ABC转运蛋白超家族成员，通过介导细胞内药物排出、改变药物在细胞内分布。这些跨膜转运蛋白能够利用ATP水解释放能量而实现底物分子在胞膜内外的逆浓度梯度转运[2]。夏天保等对60例银屑病患者及60例健康对照者,分别用聚合酶链反应技术(PCR)及测序分析基因组DNA的突变等位基因，结果证实银屑病组血小板活化因子乙酰水解酶基因突变率(Ala379Val)与健康人群差异无统计学意义(P＞0.05)[3]。银屑病是一种表皮过度增生且炎性浸润较为严重的反复复发的皮肤病，我们推测过度的表皮增生可能与机体皮肤细胞的能量代谢有关。该基因如何在银屑病发病机制中传导通路仍需后续的实验研究。对银屑病的基因学研究也有助于揭示临床疗效确切的药物的可能作用机制。杨积顺等研究发现芥子气可抑制真皮成纤维细胞的增生,诱导其凋亡,该效应可能与芥子气促进TRAILR1的表达有关[4]。同时对其诱导分泌TRAIL因子的时效和量效关系进行了深入探讨[5]。在本研究中，我们本次的研究结果从基因组学的角度反映出银屑病患者与健康人之间存在着差异表达基因，从差异值比较中可以找出银屑病患者的标志基因，从而可以为银屑病靶点药物的研究提供理论基础，也为进一步寻找银屑病的生物标志物提供科学依据。

[1]Mee JB，Johnson CM，Morar N，et al.The psoriatic transcriptome closely resembles that induced by interleukin-1 in cultured keratinocytes:dominance of innate immune responses in psoriasis[J].Am J Pathol JT-The American journal of pathology，2007，171(1)：32-42.

[2]Dean M，Rzhetsky A，Allikmets R.The human ATP-binding cassette(ABC)transporter superfamily.Genome Res，2001，11(7)：1156-66.

[3]夏天保，吕世超，毕新岭，等.PAF-AH基因突变与银屑病的相关性研究[J].中国麻风皮肤病杂志，2008，24(9)：686-89.

[4]杨积顺，胡晋红，朱全刚，等.芥子气诱导人真皮成纤维细胞的凋亡研究[J].药学服务与研究，2009，9(3)：178-181.

[5]杨积顺，徐立平，胡晋红.芥子气诱导真皮成纤维细胞分泌肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体的时效和量效研究[J].中国药业，2012，21(6)：29-30.