大鼠坐骨神经移植后脊髓相应节段运动神经元中P-Erk1/2的表达和变化

朱春雷 吕树振 赵世伟

当周围神经损伤后，脊髓前角运动神经元胞体都会发生损伤性反应，都有一定数量的神经元胞体死亡，神经元胞体的变化在再生调控中起重要的作用，而神经元胞体内的变化是错中复杂的，研究周围神经损伤后神经元凋亡途径的激活等对抑制神经元的凋亡、加强神经元胞体的保护和促进神经损伤后的功能恢复有重要意义。胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是MAPK家族的一员，它的信号传递途径涉及调节细胞生长、发育及分裂，是信号网络核心，ERK1/2通过细胞分裂周期影响增殖与分化，对细胞凋亡的抑制、创伤愈合、神经的再生起重要作用[1]。目前对坐骨神经切断后P-Erk-1/2的表达变化，尚未见报道。本实验通过对大鼠坐骨神经切断术后在不同时相P-ERK1/2表达的检测，为神经细胞凋亡的调控研究提供可靠的实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物 吉林大学动物实验室购置10W～12W成年Wister大鼠（约250克）共80只，并随机分为假手术组（A组）和坐骨神经切断组（B组），每组40只；

主要试剂：一抗P-ERK1/2-1（Promega公司）、β-actin（Sigma公司）、SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒( Santa Cruz 公司)，使用浓度及方法严格按照说明书配置。

1.2 模型制备与取材 3%戊巴比妥钠40 mg／kg腹腔麻醉大鼠后常规消毒，做右侧臀部斜切口,钝性分离肌肉，暴露坐骨神经。假手术组中的动物模型暴露坐骨神经后逐层缝合皮肤；将坐骨神经切断组中的动物模型的坐骨神经完全切断,在12倍手术显微镜下将其神经两端正确对位后，用9-0无损伤线吻合断端4～6针，并逐层缝合皮肤。

取材：将每组5只大鼠，经3%戊巴比妥40mg/kg腹腔注射麻醉，待生效后常规消毒，切取L4～L6段脊髓右侧标记好后浸置于液氮中备有。

1.3 western- blot方法 快速将液氮中的组织取出，分离提取蛋白，测定浓度，每泳道15ug总蛋白进行10% SDS－PAGE电泳，转至PDVF膜，一抗p-Erk1/2抗体(1:2,500)，4℃摇床轻摇孵育过夜，二抗Goat Anti Rabbit IgG, FITC偶联抗体（1：5000）室温摇床轻摇2h；按ECL 显色试剂盒说明书操作显色，X 光胶片曝光，然后进行条带扫描和分析P-ERK1/2表达。

1.4 统计学方法 将western-blot条带扫描和分析，各组数据以±s表示，采用SPSS10.0版软件进行统计分析，组间t检验比较，P<0.05具有统计学意义。

2 结果

P-Erk1/2随时相的改变在脊髓中表达情况 通过应用western-blot方法对大鼠坐骨神经切断后相应脊髓阶段中PErk1/2表达的检测发现，P-Erk1/2在L4～L6在脊髓中的表达随时间的变化而改变，如图2所示，在假手术组中脊髓前角运动神经元中的P-ERK1/2仅有少量表达并维持一定的水平；坐骨神经切断组在坐骨神经切断后1W内P-ERK1/2表达增加、2W达高峰、8W恢复正常水平。各组间数据分析在1W～4W组中PErk1/2表达坐骨神经切断组明显高于假手术组（P<0.05）具有统计学意义。见图1、图2。

图1 大鼠坐骨神经切断后P-Erk1/2在脊髓中的表达Fig1.Expression of phospho-Erk1/2 in rat spinal cord after sciatic nerve transaction

图2 大鼠坐骨神经切断后P-Erk1/2在脊髓中的分析

3 讨论

有关神经损伤后胞体反应性的变化的研究结果认为，神经损伤后胞体的变化主要与神经元的类型、生物体的年龄、损伤部位到胞体的距离、轴突延伸的环境、神经元的兴奋性及损伤类型有关[1]，而这些因素又与神经损伤后的再生特性密切关联，在周围神经损伤与再生过程中神经元胞体内在自身修复的过程中发生一系列的变化，同时存在细胞间的微环境变化及信号的产生与传导。

本实验通过应用western-blot方法分析、比较假手术组与坐骨神经切断组在不同时相P-Erk1/2蛋白量的表达变化，从实验结果中看到在假手术组中也存在着P-ERK1/2的表达，但表达的量较低，而且不随时间的变化而发生改变，说明了手术并不会对相应节段脊髓P-Erk1/2蛋白量的表达产生影响，在坐骨神经切断组中1W时已经呈阳性表达，在2W时达到高峰后逐渐下调，至8W时其表达接近假手术组水平，由此可见P-ERK1/2的表达具有时间依赖性，同时我们也注意到假手术组和坐骨神经切断组在各时相的表达存在差异：在术后1W时坐骨神经切断组中P-ERK1/2表达明显高于假手术组，说明坐骨神经切断后带来的刺激在1W内就激活了MAPK /ERK1/2信号通路，活化后的ERK(p-ERK)转位至细胞核内对转录因子磷酸化而调节转录活性，这样它就起到一个承上启下的作用，将胞外信号传导到核内[2]。被激活的ERK将特定的底物磷酸化，如磷脂酶、转录因子和细胞结构蛋白等，通过这一途径，被激活的蛋白质发挥一系列生理作用，如基因表达、有丝分裂、增生、移动和新陈代谢等[3]。P-ERK1/2再将其他各种各样的底物，包括细胞膜蛋白、核蛋白、转录因子以及几种MAPK激活蛋白激酶（MKs）等磷酸化促使神经元胞体合成神经再生所需要的各类蛋白增加，促进神经元轴突的再生；而且P-ERK1/2能抑制caspase-9的活性，进而抑制caspase-3，从而抑制凋亡[4]，推测坐骨神经切断1W时在各种因素的刺激下促进轴突生长以及相关促进生长的蛋白及因子的合成加快，并且降低了神经元凋亡的发生；而在假手术组中并未发生明显的变化，表明在未切断坐骨神经的手术过程中，并不会激活MAPK/ERK kinase途径。在坐骨神经切断术后2W 时P-ERK1/2 的表达达到了高峰，表明P-ERK1/2在各种因素的刺激下，持续激活MAPK/ERK途径并发挥作用，在此时期可能是有丝分裂加速最快、蛋白合成最多、轴突生长最快的时期；PERK1/2表达逐渐下调，表明基因表达、有丝分裂、增生、移动和新陈代谢包括细胞膜蛋白、核蛋白、转录因子等下调或降低[5]。

通过本实验的结果可以推断在坐骨神经切断术后4～8W时神经元的再生能力会逐渐降低。各组间数据分析在1W～4W组中P-Erk1/2表达坐骨神经切断组明显高于假手术组（P<0.05）具有统计学意义，其两组中各时相表达结果与免疫组化的实验结果基本一致，实验结果可靠。说明坐骨神经切断后，MAPK/ERK1/2信号途径在1W内就已经被激活而发挥调控作用。

神经损伤后，再生信号立刻启动，虽然调控细胞凋亡的激活和抑制机制还未阐明，但通过本实验证明了周围神经损伤后确实出现P-ERK上调，进而发挥抗凋亡促进轴突再生的作用。因此如果能研究出一种能持续调控MAPK/ERK1/2信号通路的方法,将有利于加强神经元胞体的保护,促进神经损伤后的功能恢复，在临床应用中具有重要意义[6]。

[1]Vicki Waetziga, Thomas Herdegen.The concerted signaling of ERK1/2 and JNKs is essential for PC12 cell neuritogenesis and converges at the level of target proteins[J].Molecular and Cellular Neuroscience,2003, 21(1):238-249.

[2]Colucci-D, Amato L, Perrone-Capano C, et al.Chronic activation of ERK and neurodegenerative diseases[J].Bioessays,2003,25(11):1085-1095.

[3]Philippe P，Roux and John Blenis，ERK and p38 MAPK-Activated Protein Kinases: a Family of Protein Kinases with Divers e Biological Functions[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2004,68(2).320-344.

[4]Allan L.A., Morrice N., Brady S., et al.Inhibition of caspase-9 through phosphorylation at Thr 125 by ERK MAPK[J].Nat.Cell.Biol 2003, 5(7):647-654.

[5]Michaela Moors, Jason E.Cline, Josef Abe, et al.ERK-dependent and -independent pathways trigger human neural progenitor cell migration[J].Toxicology and Applied Pharmacology,2007, 221(1):57-67.

[6]朱春雷,吴广志,徐明珠,等.大鼠坐骨神经切断术后在背根神经节中P-Erk1/2表达和变化[J].中国实验诊断学,2009,13（3）：345-347.