Ⅱ型糖尿病前期伴牙龈炎患儿牙周可疑致病菌的检测

蔡梁婧，邰佰霞，王永兰，郭宏磊，朱志颖

(天津医科大学口腔医院，天津 300070)

Ⅱ型糖尿病是仅次于年龄、牙石的第三位牙周炎危险因素［1］。目前，Ⅱ型糖尿病的发病人群已不再局限于中老年人，而是呈现低龄化趋势，甚至在儿童时期就已存在糖尿病前期的状态。糖尿病前期是一种处于葡萄糖代谢正常与糖尿病之间的中间阶段，又称为糖调节受损。研究显示:糖尿病前期人群进展为糖尿病的比例明显高于普通人群［2－3］。糖尿病与牙周病发病存在共同危险因素且互为高危因素，研究表明:在局部刺激因素相似的情况下，有糖尿病者的牙周病发生率和严重程度均大于无糖尿病者［1］。目前，牙龈炎在儿童、青少年中的患病率为70% ～90%，而控制不佳的牙龈炎可发展为牙周炎，且早期牙龈炎也可因临床表现不明显，易误认为正常牙周组织而延误治疗。牙龈炎主要受细菌活动性的影响，但也可受全身状况的影响。因此，进一步明确牙龈炎的危险因素，有效地预防和控制牙龈炎的发生、发展显得尤为重要。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

无水乙醇、去离子水、Na2EDTA·2 H2O、(北京Solarbio公司);琼脂糖、SuperMix、Trans100bp、DNA Marker(北京Transgen公司);通用引物、特异性引物(北京Sunbiotech公司);口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(北京Tiangen公司);紫外分光光度仪、超净工作台、微量加样器、低温超速离心机、振荡器(Eppendorf公司，德国);PCR扩增仪(美国AB公司);恒温水浴箱HWT－6、电泳仪、电泳槽、自动凝胶成像分析仪(北京六一设备有限公司)等。

菌种来自于首都医科大学，分别为 Pg ATCC33277 、Fn ATCC25586 、Tf ATCC43037 、Pi ATCC25611、Aa ATCC24523。

1.2 受试对象选择

以到天津医科大学口腔医院接受口腔健康检查的6～14岁儿童为对象，知情同意并由天津医科大学伦理委员会审查批准后，进行如下检查。

1.2.1 血糖检测

分别采集所有参试者晨起空腹和口服75 g葡萄糖后2 h的静脉血各5 mL，以葡萄糖氧化酶法测量空腹血浆血糖(FBG)和摄糖后的血浆血糖(OGTT2hBG)含量。并参照WHO关于糖代谢分类标准［4］，以 FBG=5.6 ～ 6.1 mmol/L，OGTT2hBG ＜7.8 mmol/L或 FBG ＜ 7.0 mmol/L，OGTT2Hbg＞7.8 mmol/L且 ＜11.1 mmol/L 者诊断为糖尿病前期。FBG ＜5.6 mmol/L，OGTT2Hbg＜7.8 mmol/L者诊断为血糖代谢正常。

1.2.2 牙周检查

由3名经统一培训并经标准一致性检验合格(Kappa值＞0.7)的牙周科医生检查所有参试者的PD、SBI、PLI等牙周各临床指标，并参照文献［5］，以探诊出血且PD≤3 mm，无附着丧失者诊断为牙龈炎;以无探诊出血且PD≤3 mm，无附着丧失者诊断为牙周健康。

1.2.3 研究对象确定

根据以上检查和诊断标准，分别选取糖尿病前期且伴有牙龈炎者(实验组)30例，其中男17例，女13例，平均年龄(9.31±1.73)岁;血糖代谢正常但有牙龈炎者(单纯牙龈炎对照组)30例，其中男14例，女16 例，平均年龄(9.83 ±1.52)岁;血糖代谢正常且牙周健康者(正常对照组)30例，其中男16例，女14 例，平均年龄(10.25 ±1.36)岁(表1)。

排除标准:①3个月内使用抗生素;②有呼吸、消化、泌尿等系统或身体其他部位的炎症感染;③有其他严重全身疾病及并发症;④半年内接受牙周治疗，包括龈上洁治术、根面平整术、牙周手术等;⑤经牙周检查有严重口腔疾病，或存在附着丧失;⑥由于个人原因无法完成检查者。

表1 各组牙周临床指标()

表1 各组牙周临床指标()

临床指标 实验组 单纯牙龈炎组 正常对照组PLI 2.30 ±0.84 2.04 ±0.71 1.98 ±0.54 SBI 1.13 ±1.07 1.04 ±1.07 0.81 ±0.22 PD 1.62 ±0.43 1.41 ±0.27 1.21 ±0.11

1.3 牙周可致病菌检测

1.3.1 龈下菌斑样本采集

以所有受试对象的上颌第一恒磨牙和恒切牙为受检牙，隔湿并吹干牙面后，用无菌刮匙仔细去除龈上菌斑后，用龈下刮匙插入龈沟底采集龈下菌斑，立即放入装有1 mL PBS的离心管中，冷冻(－70℃)保存备检。

1.3.2 菌斑DNA提取及其纯度测定

采用口腔拭子基因组DNA提取试剂盒并参照其说明书的操作步骤提取菌斑DNA，然后用紫外分光光度仪测量在260 nm和280 nm处的吸光度(OD值)并计算比值。比值介于1.7～2.0表示DNA纯度良好适合PCR检测要求。同时按照下列公式计算浓度:DNA浓度(μg/mL)=OD260×50×稀释倍数。

1.3.3 引物合成

5种微生物的引物均来自16SrRNA的基因，由北京奥柯生物技术有限公司合成(表2)。

1.3.4 PCR 扩增

反应体系:SuperMix 12.5 μL，引物(10 U)2 μL，无菌双蒸水 9.5 μL，细菌 DNA 1 μL，总体积25 μL。

反应条件:通用引物、Pg、Fn、Tf特异性引物的反应条件是:94℃预变性5 min后，进入主循环，包括36个循环:94℃变性45 s，55～60℃退火60 s，72℃延伸60 s，最后72℃延伸7 min;Aa、Pi引物的反应条件:94℃预变性5 min后，94℃变性45 s，55℃退火1 min，72℃延伸90 s，36个循环后，72℃延伸7 min。

1.3.5 扩增产物的检测

取扩增产物5 μL，用20 g/L琼脂糖凝胶进行电泳，DNA染料为EB，紫外灯下观察并用自动凝胶成像分析仪拍照。每批PCR扩增设置阳性对照、阴性对照和空白对照。所有试验样本的测定均在盲法下进行，并随即抽取10%的样本做重复试验检测PCR结果的可靠性。

应用电泳凝胶成像分析软件(Fluorchem V2.0)分析各个电泳条带的平均灰度值(AVG)。细菌特异引物与该菌斑通用引物的PCR产物比值为该细菌的相对含量。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 实验组部分PCR产物电泳结果(图1～5)

2.2 各组龈下菌斑中牙周可疑致病菌检出率(表3)

5种可疑致病菌的检出率均以实验组(糖尿病前期)最高，其次为单纯牙龈炎组，但与实验组相比无统计学差异(P＞0.05);而正常对照组最低，与其他两组相比均具有统计学差异(P＜0.05)。

图1 Pg特异性引物检测电泳图

图2 Pi特异性引物检测电泳图

图3 Aa特异性引物检测电泳图

图4 Fn特异性引物检测电泳图

图5 Tf特异性引物检测电泳图

表3 各组龈下菌斑中牙周可疑致病菌检出率比较(%)

2.3 龈下菌斑中牙周可疑致病菌的相对含量(表4)

5种可疑致病菌的相对含量均以实验组最高，其次为单纯牙龈炎组，但与实验组相比无统计学差异(P＞0.05);而正常对照组最低，与其他两组相比均具有统计学差异(P＜0.05)。

表4 各组龈下菌斑中牙周致病菌的相对含量比较(%，)

表4 各组龈下菌斑中牙周致病菌的相对含量比较(%，)

#与实验组比较P＞0.05;*与其他两组比较P＜0.05

检测菌 糖尿病组 单纯牙龈炎组 正常对照组Pg 30±12 31±12# 21±10*Aa 26±15 19±11# 16±11*Fn 18±11 19±12# 17±12*Pi 19± 4 23± 9# 8± 6*Tf 32±10 28±12# 20±18*

2.4 实验组龈下菌斑中牙周可疑致病菌的相对含量与牙周临床标之间的关系

Pg的相对含量与PD、SBI以及FBG存在相关性(P ＜0.05);Pi的相对含量与 PD、SBI、FPG、口服葡萄糖耐量实验2 h血糖(OGTT2hBG)存在相关性(P＜0.05);Aa和Fn的相对含量与SBI、PD存在相关性(P＜0.05);Tf的相对含量与 SBI、PD、FBG存在相关性(P＜0.05)(表5)。

表5 实验组细菌相对含量与牙周临床指标和血糖水平的相关性分析 (r值)

3 讨论

有研究认为:牙周病的发生是由特定的牙周致病菌感染引起的，在这些牙周致病菌中Pg、Tf、Td、Aa、Pi等均有报道［8－9］。目前，有很多研究报道了糖尿病伴成人牙周炎与牙周致病菌的相关性，但是以糖尿病前期的儿童牙龈炎病人为研究对象，用PCR法检测牙周致病菌的研究，尚未见报道。由于牙龈炎有可能发展为牙周炎，因此及时治疗牙龈炎对预防牙周炎至关重要。然而，在牙周炎初期，牙周探诊深度和附着丧失等变化不明显，早期发现和诊断牙周炎有一定困难。另外，临床检查只能发现已经发生的牙周破坏，而菌斑中细菌种类和数量的变化却先于临床改变，因此检测龈下菌斑中牙周可疑致病菌可帮助判断疾病的活动性、评价宿主的易感性、预测疾病的发生和发展［9－10］。有鉴于此，本研究选择牙周病发病关系密切的Pg、Aa、Tf、Fn、Pi 5种牙周致病菌为目标菌，用PCR方法对糖尿病前期并患有牙龈炎的6～14岁的儿童龈下菌斑进行检测，探讨上述可疑致病菌与牙周临床指标和空腹血糖之间的关系，为牙周炎的预防提供一定的理论基础。

龈下菌斑尤其是非附着龈下菌斑是牙周炎发生的始动因子，与宿主共同组成动态平衡的牙周生态系。当牙周微生物与宿主之间失去平衡，便可导致牙周炎的发生。研究表明:牙周健康时龈下菌斑以G+菌为主;牙龈炎时G－和G+菌并存;与慢性牙周炎发生、发展关系密切的非附着龈下菌斑中以G－厌氧菌为主［11］。本研究发现 Pg、Aa、Fn、Tf、Pi在实验组的龈下菌斑中均可检出，可见在儿童Ⅱ型糖尿病前期伴牙龈炎病人龈下菌斑中包括专性和兼性厌氧菌。5种可疑致病菌的检出率均以实验组最高，但与单纯牙龈炎组相比无统计学差异(P＞0.05)，可以认为此时的血糖变化未引起致病菌的种类和数量的显著变化，可能是因为儿童年龄较小，处于血糖代谢异常状况的时间还较短，龈下菌斑中可疑致病菌对牙周组织的影响效果还未显现出来。另外，因本研究样本较难获取，故样本量偏小，也可能对实验结果造成一定的影响。

Pg是慢性牙周炎的主要病原因子，Pg在诱发牙周组织的炎症反应后更易在局部微环境内生存，从而对牙周组织产生进一步的破坏［12］。本研究中Ⅱ型糖尿病前期儿童牙龈炎病人Pg的检出率和相对含量为(46.67，30 ±12)%，且与 PD、SBI、以及 FBG存在显著相关性(P＜0.05)，说明Pg在Ⅱ型糖尿病前期伴牙龈炎患儿的龈下菌斑中的含量与牙周临床指标密切相关，较单纯牙龈炎病人更易发展为牙周炎。有研究显示:青少年和年轻成年人检出Pg等红色复合体微生物者存在感染牙周病的风险［13］。Aa菌对牙周组织的致病作用包括降低宿主免疫力，促进骨吸收和组织破坏，本研究中，实验组Aa的相对含量与PD、SBI有显著相关性。较多报道认为PI与中、重度牙龈炎、急性坏死性溃疡性牙龈炎和妊娠性龈炎有关［14］，可在龈袋、冠周炎等部位中检出。在本研究中，实验组Pi的相对含量与SBI、PD、FBG和OGTT2hBG存在显著相关性(P＜0.05)。Tf是目前公认的牙周炎证据最为充分的3大主要致病菌之一，与牙周附着丧失明显相关［15－16］。在本研究中实验组Tf的检出情况与PD、SBI、FBG存在显著相关性。Klein 等［17］发现:PD≤5 mm 时，Pi、Tf的联合检出率为30%;当PD＞5 mm时，两细菌联合检出率为90%。另外有研究显示:血糖控制良好的糖尿病病人与控制不良的病人间牙周探诊出血指数［(2.9±0.4)VS(3.1 ±0.5)，P ＜0.05］和附着丧失差异均有统计学意义［(1.7 ±1.5)mm VS(2.8 ±2.3)mm］，说明血糖水平与其牙龈炎症的程度和牙周破坏的程度相关，并提示对于伴糖尿病的牙周病病人必须有效地控制血糖才能消除或减少糖尿病对牙周病的影响，反之牙周炎的系统治疗也将有利于血糖的控制［18］，均与本研究结果一致。Fn的相对含量与PD、SBI存在一定的相关性，但是与FBG、OGTT2hBG之间不存在相关关系，可能是由于Fn是不分解糖的细菌，不能直接利用糖进行新陈代谢，因此FBG、DGTT2hBG变化可能对Fn数量影响不大。

根据本研究结果可认为:对于Ⅱ型糖尿病前期患儿，要保证其良好的口腔卫生，防止牙龈炎的发生;对已患牙龈炎的Ⅱ型糖尿病前期患儿，要控制其血糖水平，积极治疗牙龈炎以防止牙周炎的发生。

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