加味小青龙汤及其拆方对变应性鼻炎大鼠鼻黏膜病理形态和IL-4含量的影响

王树鹏 郭晓东 李海波 张丽艳 曲道炜

加味小青龙汤临床应用治疗变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)疗效确切[1]，临证中发现很多AR患者存在阳气不足，水饮内停之表现，加味小青龙汤具有益气温阳化饮之功用，为深入研究加味小青龙汤益气温阳化饮的作用机制和配伍规律，本课题组制备了变应性鼻炎的大鼠模型，以AR大鼠血浆IL-4和鼻黏膜病理形态为指标，对加味小青龙汤进行拆方研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物

清洁级健康雄性Wistar大鼠90只，体重为200～240 g。由辽宁中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：2000量认(辽)字(S2011)号。

1.2 分组方法

按照成组实验设计方法，将大鼠按体重采用随机区组法分为9组，每组10只。分别为：(1)正常对照组；(2)模型组；(3)益气组(黄芪6 g、白术9 g、防风6 g)；(4)温阳组(麻黄9 g、桂枝9 g、白芍9 g、炙甘草9 g)；(5)化饮组(干姜9 g、细辛5 g、五味子9 g、半夏9 g)；(6)益气温阳组(黄芪6 g、白术9 g、防风6 g、麻黄9 g、桂枝9 g、白芍9 g、炙甘草9 g)；(7)益气化饮组(黄芪6 g、白术9 g、防风6 g、干姜9 g、细辛5 g、五味子9 g、半夏9 g)；(8)温阳化饮组(麻黄9 g、桂枝9 g、白芍9 g、炙甘草9 g、干姜9 g、细辛5 g、五味子9 g、半夏9 g);(9)加味小青龙汤组(麻黄9 g、桂枝9 g、白芍9 g、炙甘草9 g、干姜9 g、细辛5 g、五味子9 g、半夏9 g、黄芪6 g、白术9 g、防风6 g)。

1.3 试验用药

实验用中药购自辽宁中医药大学附属医院，经辽宁中医药大学药用植物教研室鉴定均为正品。生药剂量根据《伤寒论》小青龙汤原方剂量比例进行配比。各治疗组药物煎煮后浓缩成含生药量1 g/ml的浓缩液。

1.4 试剂与仪器

(1)试剂：卵白蛋白：上海化学试剂厂(20090508)。吸附白百破疫苗由辽宁中医药大学疾病预防中心提供，规格5.0 ml/支，批号：201001009-2。氢氧化铝：沈阳市试剂三厂(批号：20080912)。(2)主要仪器：切片机型号为AO-820(美国制造)；荧光显微镜型号为OLYMPUS(日本制造)；照相机型号为OLYMPUS C-35AD-2(日本制造)。

1.5 造模方法[2]

乙醚麻醉大鼠，在大鼠左右前肢、后肢跖部分别注射0.1 ml、0.2 ml的抗原佐剂混悬液致敏。初次致敏5天后强化致敏，将0.5 mg卵自蛋白溶解于1 ml生理盐水注入大鼠背部。初次致敏第7天开始用卵白蛋白滴鼻，1次/天，10 μl/次。连续滴鼻7天。之后隔日给予卵白蛋白1 g/L滴鼻，以维持对鼻黏膜的刺激。连续灌胃给药4周，每隔7天观察一次鼻部滴蛋白液30分钟内搔鼻次数和喷嚏次数。

1.6 症状分级标准

采取记分法记录鼻分泌物量、喷嚏次数及鼻痒程度。方法如下：(1)鼻涕：流至前鼻孔1分；超过前鼻孔2分；涕流满面3分。(2)喷嚏：4个以内1分；5～10个2分；10个以上3分。(3)鼻痒：轻度抓鼻1分；频繁抓鼻2分；抓鼻不止3分。自鼻腔激发开始观察30分钟，采用叠加法记分，总分超过5分为动物造模成功[3]。

1.7 给药方法

按照《药理实验方法学》[4]人与动物等效剂量换算方法，人与大鼠药物每公斤体重剂量之比约为1∶6，因此各组药物灌胃剂量如下：(1)正常对照组：按照每100 g大鼠体重予以1 ml生理盐水灌胃；(2)模型组：同正常对照组；(3)益气组：按每1 kg大鼠体重予以2.1 ml所试药物煎剂(相当于2.1 g生药)灌胃；(4)温阳组：按每1 kg大鼠体重予以3.6 ml所试药物煎剂(相当于3.6 g生药)灌胃；(5)化饮组：按每1 kg大鼠体重予以3.2 ml所试药物煎剂(相当于3.2 g生药)灌胃；(6)益气温阳组：按每1 kg大鼠体重予以5.7 ml所试药物煎剂(相当于5.7 g生药)灌胃；(7)益气化饮组：按每1 kg大鼠体重予以5.3 ml所试药物煎剂(相当于5.3 g生药)灌胃；(8)温阳化饮组：按每1 kg大鼠体重予以6.8 ml所试药物煎剂(相当于6.8 g生药)灌胃；(9)加味小青龙汤组：按每1 kg大鼠体重予以9.0 ml所试药物煎剂(相当于9.0 g生药)灌胃。各组每天一次灌胃给药。

1.8 疗效评定标准

参考1997年在海口修订AR诊断标准和疗效评定标准[5]，治疗后症状累计积分减少2或3分为显效，减少1分为有效，无变化或加重为无效。

1.9 取样及检测方法

将大鼠用25%乌拉坦腹腔麻醉，仰卧位固定。剪开颈部皮肤，钝性分离，暴露颈动脉，用一次性注射器抽取颈动脉血3 ml，立即注入抗凝管中，静置2小时后3000转/分离心15分钟，分取血浆，-20℃保存并送检。IL-4、TNF-α含量检测采用ELISA法，严格按试剂盒说明进行操作。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 给药前后症状积分情况

造模后，造模各组大鼠症状累计积分平均达到5分以上，与正常对照组有统计学意义(P<0.05)，表明造模成功。经过药物治疗，各药物治疗组大鼠症状较模型组均有所减轻，与模型组相比具有统计学意义(P<0.05)。其中加味小青龙汤组明显降低，与益气组、温阳组、化饮组、益气化饮组、益气温阳组、温阳化饮组相比较有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。

表1 给药前后症状积分比较

注：与正常对照组比较aP<0.05，与模型组相比较bP<0.05，加味小青龙汤组与各治疗组相比较cP<0.05

2.2 鼻黏膜组织病理形态学的变化

鼻黏膜组织光镜检查：正常对照组鼻黏膜上皮完整，无炎症反应(见图1);模型组可见鼻黏膜水肿、充血，上皮不完整，重度炎细胞浸润，嗜酸粒细胞浸润明显，黏膜上皮坏死(见图2);益气组、温阳组、化饮组鼻黏膜有充血，中度炎细胞浸润(见图3、4、5);益气温阳组、益气化饮组鼻黏膜有充血，少量炎细胞浸润(见图6、7);温阳化饮组鼻黏膜上皮完整、黏膜少有充血，有少量炎细胞浸润(见图8);加味小青龙汤组鼻黏膜轻度充血，炎细胞消失(见附图9)，尤以加味小青龙汤治疗组恢复最好。

图1 正常对照组鼻黏膜组织形态(HE染色10×40)

图2 模型组鼻黏膜组织形态(HE染色10×40)

图3 益气组鼻黏膜组织形态(HE染色10×40)

图5 化饮组鼻黏膜组织形态(HE染色10×40)

图6 益气温阳组鼻黏膜组织形态(HE染色10×40)

图7 益气化饮组鼻黏膜组织形态(HE染色10×40)

图8 温阳化饮组鼻黏膜组织形态(HE染色10×40)

图9 加味小青龙汤组鼻黏膜组织形态(HE染色10×40)

2.3 AR大鼠血浆IL-4含量测定结果

模型组IL-4含量明显升高，与正常对照组比较有统计学意义(P<0.01)，各治疗组IL-4的含量降低，与模型组相比具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，提示各给药组均具有不同程度的降低IL-4含量的作用。化饮组、益气温阳组、益气化饮组、温阳化饮组与益气组、温阳组比较有统计学意义(P<0.01)。其中以加味小青龙汤治疗组效果最好，与益气组、温阳组、化饮组、益气化饮组、益气温阳组、温阳化饮组相比较有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，结果见表2。

表2 加味小青龙汤对AR大鼠血浆IL-4含量的影响

注：与模型组相比较aP<0.05，bP<0.01，加味小青龙汤组与各治疗组相比较cP<0.05,各治疗组与益气组、温阳组相比较dP<0.01

3 讨论

加味小青龙汤治疗AR临床效验显著，是在中医基本理论指导下，结合现代药理学研究成果进行组方的。本方是以小青龙汤、玉屏风散合方，具有益气温阳化饮之功用。而AR在发作期多数体现出其病机特点为阳气虚弱，水饮内停[6]，故用作加味小青龙汤及其拆方的实验研究。

3.1 症状积分观察

AR属Ⅰ型变态反应反应，以鼻局部的集中症状鼻痒、喷嚏、流涕为主要临床表现，因此减轻局部症状是改善和调整Ⅰ型变态反应的客观依据，构成了变态反应性鼻炎的诊断和疗效评定标准的主要内容[7]。本实验的研究结果提示：在给药前，各治疗组和模型组症状积分与正常对照组相比具有统计学意义(P<0.05)，并且总积分超过5分，表明模型制造成功。经过治疗后，各治疗组喷嚏、搔鼻、流涕的积分值显著减少，与模型组相比具有统计学意义(P<0.05)，且总积分减少2～3分，表明各治疗组均能改善AR大鼠的症状，其中以加味小青龙汤治疗组效果最显著。

3.2 鼻黏膜病理形态的观察

根据对大鼠AR鼻黏膜形态学的观察，模型组可见鼻黏膜水肿、充血，上皮不完整，重度炎细胞浸润，嗜酸粒细胞浸润明显，黏膜上皮坏死(见图2)，与文献报道一致[8]，各治疗组均不同程度的改善了鼻黏膜的病理形态，其中尤以加味小青龙汤治疗组鼻黏膜病理形态恢复最好，其治疗作用是通过抑制了炎症细胞在鼻黏膜的聚集，减少了肥大细胞脱颗粒，进一步促进了鼻黏膜的修复，这与症状积分改善程度相一致，提示鼻黏膜组织形态学的改变与疗效相一致，因此鼻黏膜组织形态学研究可用于AR疗效评价。

3.3 对IL-4含量的影响

本研究通过检测AR大鼠血浆中IL-4含量反映Th2细胞亚群的状况，并从此角度来探讨加味小青龙汤及其拆方对IL-4含量的影响。由实验结果可知，各治疗组与模型组比较均有统计学意义，提示各治疗组均有不同程度调节IL-4含量的作用。其中，化饮组、益气化饮组、温阳化饮组优于益气组、温阳组，说明化饮在治疗AR中具有重要作用。益气温阳组优于益气组、温阳组，揭示二者起协同作用。加味小青龙汤组疗效优于各治疗组，说明温阳、益气、化饮在治疗AR中表现出协同增效的整体调节作用，体现了加味小青龙汤配伍的高度科学内涵。当然，单纯依据血浆IL-4含量这一指标，也不可能对加味小青龙汤及其拆方的作用进行综合评价，目前我们正在从免疫调节网络的角度开展相关研究，有望获得更加系统全面的结果，为加味小青龙汤配伍规律的研究提供新的线索。

参考文献

[1] 王树鹏, 郭晓东, 张丽艳, 等. 小青龙汤加味对变应性鼻炎大鼠IL-5和TNF-α含量的影响[J]. 中医药学刊, 2006, 24(4): 635-637.

[2] 陈忠, 唐法娣. 大鼠过敏性鼻炎模型建立及应用[J]. 浙江大学学报：医学版, 2001, 30(6): 276-278.

[3] 张志明, 孙树岩, 季文樾. 真菌性抗原致变应性鼻炎豚鼠模型建立[J]. 中国耳鼻咽喉头颈外科, 2005, 12(5): 313-315.

[4] 徐叔云, 卞如濂, 陈修. 药理实验方法学[M]. 北京: 人民卫生出版社,1982:178-179.

[5] 中华医学会耳鼻咽喉科学分会. 变应性鼻炎诊断标准与疗效评定标准[J]. 中华耳鼻咽喉科杂志, 1998, 33(3): 134-135.

[6] 王树鹏, 刘书宇. 小青龙汤加味治疗变应性鼻炎的中医理论探讨[J]. 辽宁中医杂志, 2007, 34(5): 575-576.

[7] 顾瑞金, 顾之燕. 变应性鼻炎诊断和疗评定标准专题学术讨论会纪要[J]. 中华耳鼻咽喉科杂志, 1991, 26(3): 131-133.

[8] 刘建国, 刘月辉. 变应性鼻炎鼻黏膜结构变化及微血管重塑实验研究[J]. 中国耳鼻咽喉头颈外科, 2010, 17(1): 15-17.