PESV干预K562细胞PI3K/Akt信号通路凋亡调控的研究*

张 蕾 ，杨文华 ，于文俊，郝 征 ，张 佳

（1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193）

PESV干预K562细胞PI3K/Akt信号通路凋亡调控的研究*

张 蕾1，杨文华1，于文俊2，郝 征2，张 佳2

（1.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193；2.天津中医药大学，天津 300193）

[目的]探讨PESV对K562细胞PI3K/Akt信号蛋白及凋亡调控因子Bcl-2和Bad表达的影响。[方法]将体外培养K562细胞，经PESV处理不同时间后，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot检测PI3K及p-Akt蛋白水平变化，实时荧光定量RT-PCR检测Bcl-2、BadmRNA水平变化。[结果]与对照组相比，PESV处理后K562细胞凋亡率显著增加，PI3K及p-Akt表达降低，抗凋亡相关基因Bcl-2mRNA表达降低，促凋亡基因BadmRNA表达增加。[结论]PESV可能通过降低PI3K、Akt信号蛋白表达，调节Bcl-2和Bad表达，抑制K562细胞增殖，促进其凋亡。

PESV；K562 细胞系；凋亡；PI3K；Akt；Bcl-2；Bad

慢性粒细胞白血病（CML）简称“慢粒”，是起源于多功能造血干细胞的恶性增殖性疾病。Ph染色体自1960年在CML中被发现后，成为第一个被认识的与恶性疾病相关的细胞遗传学改变。90%以上的慢粒患者中可发现有Ph染色体，即t（9；22）（q34；q11），形成BCR/ABL融合基因，BCR/ABL介导的Ph染色体畸变被认为是CML的始动突变[1]。BCR/ABL融合基因表达的编码210 KD的BCR/ABL融合蛋白（p210）具有高度酪氨酸激酶活性，激活下游PI3K/Akt信号通路，并最终影响细胞核内调控凋亡和生存相关基因的表达，使多种癌基因表达异常,抑制白血病细胞的凋亡，最为常见的是B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）家族的信号分子，包括抑制细胞凋亡的因子（Bcl-2、Bcl-xl）和促进细胞凋亡的因子（Bad）等。笔者前期的研究证实蝎毒多肽提取物（PESV）在体内体外均能对白血病细胞有明显的促进凋亡的作用[2-3]。本研究探讨PESV对K562细胞的凋亡效应，以及对PI3K及p-Akt蛋白水平表达，及凋亡调控因子Bcl-2和Bad表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 RPMI1640、胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司；Annexin V/PI双染流式法细胞凋亡检测试剂盒购自美国Invitrogen公司；PI3K、p-Akt一抗购自英国ABCAM公司；逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒及SYBR Green荧光染料MIX购自美国Invitrogen公司。

1.1.2 药物制备 PESV系将蝎毒粗毒应用分子筛层析技术提纯所得，为分子量6 000～7 000的多肽混合物，纯度为89.1%，使用前用生理盐水溶解稀释到所需浓度。

1.1.3 细胞系 人慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞系有中国医学科学院血液学研究所提供，用含10%FBS的RPMI1640培养液培养;均在37℃、5%CO2饱和湿度环境孵育。

1.2 实验方法和步骤

1.2.1 K562白血病细胞培养 K562白血病细胞用RPMI 1640完全培养液（含10%FBS），按常规方法培养。实验时均取对数生长期细胞。

1.2.2 凋亡细胞检测 收集对数生长期细胞，离心计数，调整细胞浓度为1.0×106/mL，接种于24孔培养板，每孔体积800μL。实验组（A组）加入PESV 20μg/mL，阳性对照环磷酰胺（CTX）组（B组）加入CTX作用K562，空白对照生理盐水组（C组）加入生理盐水200μL。取24、48、72 h 3个时间点，各自取细胞离心5min，以磷酸盐缓冲液（PBS）洗2次，调节细胞浓度为5.0×105/mL，加入-20℃预冷70%乙醇2mL固定，RNase消化，4℃放置24h，PBS洗2次。每管加入PI，ANNEXIN-V双染色，计数1×104个细胞，检测细胞凋亡率，用FACSCan流式细胞仪检测和分析凋亡细胞，同时以不加ANNEXIN-V及PI的一管作为阴性对照。

1.2.3 Western印记实验 收集上述3组24、48、72 h 3个时间点K562细胞，离心计数，进行Western blot检测。进行总蛋白提取，BCA法测定蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，按每泳道40mg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后转印到PVDF膜上，用TBS-T（含 0.2%Tween20，5%脱脂奶粉）封闭 1 h；分别加入PI3K和Anti-phospho-AKT（Ser473）单克隆抗体，二抗，孵育，ECL显影，凝胶成像系统拍照，应用Gel-Pro Analyzer 4.5软件分析条带灰度值，除以β-actin内参蛋白值以校正误差，所得结果代表目的蛋白相对含量。

1.2.4 实时荧光定量RT-PCR 1）收集上述不同组3个时间点K562细胞，TRIZOL提取细胞总RNA,电泳鉴定RNA并定量，逆转录合成cDNA。2）实时荧光定量PCR反应：S YBR反应体系共20μL。反应条件为95℃ 5 min，95℃ 30秒，55℃30秒，40个循环，72℃20秒，设空白对照。各荧光曲线与基线交叉点的循环数即为 Ct值。根据 ΔC（t）=C（t）目的基因-C（t）β-actin，ΔΔC（t）=2-ΔC（t）计算目的基因与β-actin相对表达量。

表1 PCR扩增引物序列Tab.1 Primer sequenceof PCR

1.2.5 统计学方法 用SPSS 18.0统计软件分析处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PESV对K562细胞凋亡的影响 K562细胞出现时间依赖的凋亡现象。白血病细胞经药物处理24 h时，即可见到凋亡细胞上升，凋亡细胞百分比由3.63%上升到7.21%，并随时间延长而继续升高，至72 h时达到34.26%（P<0.05）。FCM定量显示，PESV作用后随时间的延长,凋亡细胞增多，在各时点，A组与B组及C组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表2。与24 h处理组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。

表2 PESV对K 562细胞凋亡的影响（±s）Tab.2 Effectof PESV on apoptosisof K 562 cells（±s）%

表2 PESV对K 562细胞凋亡的影响（±s）Tab.2 Effectof PESV on apoptosisof K 562 cells（±s）%

注：与同时点的各空白组比较，*P<0.01；与同时点的CTX阳性对照组比较，△P<0.05。

组别 凋亡率24 h 48 h 72 h A 组 3.63±0.82*△ 7.21±1.69*△ 34.26±12.14*△B 组 2.26±0.48△□ 5.85±1.43△□ 22.17±9.340△□C 组 0.48±0.25△□ 1.36±0.64△□ 04.46±1.620△□

2.2 Western blot检测 PESV对K562细胞PI3K和Anti-phospho-Akt（Ser473）蛋白的影响。各组蛋白印记清楚，PI3K分子量85KD，p-Akt分子量56KD，内参蛋白actin 43KD，内参条带图像清晰均一。A组K562细胞24、48、72 h PI3K蛋白含量在随时间延长而减少，呈现明显的时间依赖性；B组3个时间点PI3K蛋白含量在随时间延长而减少，在24、72 h两个时间点表达量均明显高于A组（P<0.05）；C组K562细胞24、48、72 h PI3K蛋白含量在随时间延长而逐渐增加，且3个时间点均高于A、B组（P<0.05），如表3。A 组K562细胞24、48、72 h p-Akt蛋白含量在随时间延长而减少，呈现较明显的时间依赖性；B组24 h p-Akt蛋白含量较高,在48、72 h两个时间点表达降低，但仍明显高于A组（P<0.05）；C组K562细胞24、48、72 h PI3K蛋白含量在3个时间点均高于 A、B 组（P<0.05），如图 1。

表3 各组不同时间点蛋白相对表达量分析结果Tab.3 Resultsof the analysisof protein relative expression in each group at different time points

2.3 实时荧光定量RT-PCR法检测PESV对K562细胞凋亡调节因子Bcl-2与BadmRNA的表达量的影响 PESV组应用荧光定量RT-PCR检测K562细胞Bcl-2mRNA，其变异系数（CV）介于1.21%～8.65%之间，分布良好。CT值为28.51～31.193（中位30.07），24、48、72 h 相对含量 RQ 值平均值分别为1.205、0.769、0.740。各时间点与阳性对照组和空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 各组K 562细胞Bcl-2m RNA表达情况Tab.2 Expression ofBcl-2mRNA in K 562 cellsineachgroup

PESV组应用荧光定量RT-PCR检测K562细胞BadmRNA，其变异系数（CV）介于0.77%～7.24%之间，分布良好。CT 值为 24.712～28.92（中位 26.35），24、48、72 h相对含量RQ值平均值分别为2.015、3.443、6.934。各时间点与阳性对照组和空白对照组相比差异有统计学意义（P<0.05），见表3。

图3 各组K 562细胞BadmRNA表达情况Fig.3 Expression ofBadmRNA in K 562 cellsin each group

3 讨论

根据其临床表现慢性粒细胞白血病属于“积聚”、“瘰疬”等范畴。其病机为风湿毒邪循经流注，风湿互结，闭阻脉络，毒损络脉之证，治以祛风除湿、解毒通络。全蝎性味咸辛平、有毒，具有熄风祛湿、解毒通络之功，为以毒治毒之要药。全蝎的有效成分蝎毒多肽（PESV），本研究中发现PESV作用后K562细胞生长受到抑制，并且作用时间与抑制率间呈现明显的依赖效应，与对照组比较差异有统计学意义。

90%以上的慢粒患者中可发现有Ph染色体，即t（9；22）（q34；q11），形成BCR/ABL融合基因[4]，BCR/ABL介导的Ph染色体畸变被认为是CML的始动突变。BCR/ABL融合基因中,主要由ABL段携带细胞恶变的主要信息，而BCR段的断裂位点主要影响疾病表型[5]，不同的BCR/ABL融合基因类型与疾病表型相关[6-7]。PI3K/Akt信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，通过影响下游通路，灭活caspase、诱导细胞周期素等相关基因转录或其转录调控子的生成及调控Bcl-2家族成员Bad、Bcl-2、及Bcl-xL表达的平衡等，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用，与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关[8-9]。

PI3K激活的Akt可以通过磷酸化作用，进一步激活或抑制其下游靶蛋白 Bad、caspase9、NF-κB等，而介导胰岛素、多种生长因子等诱发的细胞生长，经多种途径促进细胞存活，是重要的抗凋亡调节因子[10-11]。凋亡前体蛋白Bad是第一个被发现的由Akt靶向作用，并与凋亡有关的蛋白，是Akt的下游因子。Bad是Bcl-2家族成员之一，分布于线粒体外膜在细胞凋亡的调控上发挥重要作用[12]。当Akt未活化时，Bad可与Bcl-2形成复合体而表现促凋亡活性[13]。活化的Akt磷酸化Bcl-2家族中的Bad Ser136位点，引起Bad与伴侣蛋白（Chaperone）14-3-3结合，从而阻断Bad与Bcl-2形成二聚体,使Bad不能发挥促细胞凋亡作用，而游离的抗凋亡因子Bcl-2发挥抗凋亡作用[14]。

在本研究中发现PESV能显著降低K562细胞的PI3K，p-Akt的表达，有一定的时间依赖性。两个蛋白的表达随PESV作用时间的延长下调更为明显，与其诱导凋亡的效应相一致，其效应均优于环磷酰胺。说明PESV较好的抑制了PI3K/Akt信号转导途径及该通路作用的下游通路，从而通过影响调控因子促进K562细胞的凋亡。同时本研究证实，PESV在通过抑制BCR/ABL酪氨酸激酶活性进而诱导K562细胞凋亡过程中对抗凋亡蛋白Bcl-2表达有下调作用，且呈时间依赖性，同时伴有促凋亡蛋白Bax的表达升高，导致抗凋亡和促凋亡因素的比例下降，使细胞走向凋亡。

慢性粒细胞白血病的发病机制提示笔者通过研制新的酪氨酸激酶抑制因子，抑制蛋白酶体或通过作用于BCR/ABL下游的靶向信号途径[15]，对慢性粒细胞白血病的治疗可能是一个新的有效的途径，也为治疗慢粒寻找基因靶向治疗药物提供了思路。本研究在一定程度阐明中药全蝎提取物PESV促进慢性粒细胞白血病细胞的凋亡，干预PI3K、p-Akt信号蛋白表达，进而起到调控下游信号因子Bcl-2与Bad的表达，起到促进人慢性粒细胞白血病细胞K562细胞凋亡的作用。

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Study on PI3K/Aktmessenger passage and apoptosis controlling in PESV-preconditioned K 562 cells

ZHANGLei1,YANGWen-hua1,YUWen-jun2,HAOZheng2,ZHANG Jia2
（1.The FirstHospital Affiliated of Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China;2.Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,Chin a）

[Objective]To investigate the effectof PESV on the expression ofmassage protein PI3K/Akt,apoptosis regulators Bcl-2 and Bad expression in K562 cells.[Methods]In vitro cultured K562 cells preconditioned with PESV for different timeswere determined for cellapoptosis ratewith cytoflowmeter,the level of PI3K and p-AKT protein with Western blotand Bcl-2,Bad mRNA level by realtime fluorescence quantitative RT-PCR.[Results]Compared with the controlgroup,the apoptosis rate of PESV treated K562 cellswas significantly increaseds,the expression of PI3K and p-Aktand anti-apoptosis-related gene Bcl-2mRNA was decreased;the expression of proapoptotic gene BadmRNAwas increased.[Conclusion]PESVmay regulate the expression of Bcl-2 and Bad,inhibit the proliferation of K562 cellsand promote theirapoptosisby reducing the expression of PI3K and Aktsignaling protein.

PESV;K562 cell lines;apoptosis;PI3K;Akt;Bcl-2;Bad

R733.72

A

1672-1519（2012）03-0274-04

教育部博士点基金项目（20091210110004）。

张 蕾（1978-），女，硕士，主治医师，研究方向为中西医结合血液病临床和科研。

杨文华。

2012-02-28）