应用药物溶出/吸收仿生系统研究三七总皂苷与冰片的配伍规律*

顾 慧 ，马叶涛 ，寻明金，时晓燕 ，何 新 ，2

（1.天津中医药大学中药学院，天津 300193；2.天津市现代中药重点实验室，天津 300193）

应用药物溶出/吸收仿生系统研究三七总皂苷与冰片的配伍规律*

顾 慧1，马叶涛1，寻明金1，时晓燕1，何 新1，2

（1.天津中医药大学中药学院，天津 300193；2.天津市现代中药重点实验室，天津 300193）

[目的]以三七总皂苷（PNS）中3种主要活性成分人参皂苷Rg1（Rg1）、人参皂苷Rb1（Rb1）和三七皂苷R1（R1）为质控成分，应用药物溶出/吸收仿生系统（DDAS S）研究PNS与冰片配伍前后的肠透过规律，并探讨其吸收机制，以期将该系统用于创新中药开发和处方筛选，为传统中药研究提供新的方法。[方法]建立同时测定PNS中Rg1、Rb1和R1的高效液相色谱（HPLC）方法；应用DDASS法，考察PNS与冰片配伍前后3种成分的肠累积透过量（Qt）及表观渗透系数（Papp）的变化；SPSS软件进行统计学分析。[结果]PNS单用时Rg1、Rb1和R1的Papp值分别为（0.49±0.09）cm/秒、（0.07 ±0.03）cm/秒、（0.58±0.04）cm/秒；PNS 与冰片配伍后 Rg1、Rb1和 R1的 Papp分别为（1.17±0.08）cm/秒、（0.16±0.02）cm/秒、（1.57± 0.50）cm/秒，分别是单用PNS的2.4、2.2和 2.7倍；而与外排转运蛋白 P-糖蛋白（P-gp）抑制剂环孢素 A（CsA）合用时，这 3种成分的 Papp值分别为（0.62 ± 0.09）cm/秒、（0.12 ± 0.04）cm/秒、（0.90 ±0.26）cm/秒，与PNS单用组均无统计学意义（P>0.05）。[结论]PNS中Rg1、Rb1和R13种成分均为低渗透性成分；冰片可显著提高PNS的Qt和Papp，促进其口服吸收；CsA对PNS的Qt和Papp没有显著影响，推测Rg1、Rb1和R1不是P-gp的底物，冰片提高其Qt和Papp可能主要受细胞旁路机制影响。

人参皂苷 Rg1；人参皂苷 Rb1；三七皂苷 R1；药物溶出/吸收仿生系统（DDASS）；表观渗透系数（Papp）

药物溶出/吸收仿生系统（DDASS）是近几年发展起来的连续动态评价药物溶出和跨膜透过特征的新型评价技术[1-4]。2003年He等[3]将该体系用于解析经口投药后药物的崩解、溶出和膜透过规律；2004年He等[4]建立了不同的胃酸模型，研究不同胃酸情况下对制剂的药物溶出率和跨膜吸收率的影响。在此基础上本课题组对该体系进行了改进，成功用于评价丹酚酸B缓释片的释药规律[5]以及单硝酸异山梨酯4种不同制剂的释药规律及体内外相关性研究[6]。本文采用新型药物溶出/吸收仿生系统探讨复方丹参方中三七总皂苷（PNS，以Rg1、Rb1和R1为检测成分）与冰片配伍前后的跨膜透过性、吸收机制等，为创新中药研究提供一种新技术和新方法，提高新药研发的成药性。此前有采用大鼠在体单向灌流模型[7]、大鼠不翻转肠囊模型[8]、Caco-2细胞模型[9]、体内动物吸收模型[10]等不同方法对传统药方复方丹参方中PNS或PNS与冰片的配伍对进行膜透过性、吸收机制等研究的报告，为验证DDASS方法提供了可行性。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 三七总皂苷（人参皂苷Rg1>20%、人参皂苷Rb1>30%、三七皂苷R1>5%，南京泽郎医药科技有限公司）；人参皂苷Rg1对照品（批号：110745200702，纯度98%）、人参皂苷Rb1对照品（批号：110704200921，纯度 92.6%）、三七皂苷 R1对照品（批号：110704200921，纯度 98%）、冰片（批号：1107432200904）、环孢素 A（CsA）对照品（批号：30495200202），均购自中国药品生物制品检定所；水为纯水，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 实验动物 Wistar大鼠，雄性，体质量（250±20）g，购买于中国医学科学院放射医学研究所，动物合格证号：SYXK（津）2009-0001。在（25±2）℃，相对湿度45%～65%，光照/黑暗为12 h/12 h条件下饲养，自由饮食、饮水，适应性饲养1周后开始实验。

1.3 仪器

1.3.1 主要仪器 Merrler Toledo AX205十万分之一天分析天平（瑞士MettlerToledo公司）；Waters600E自动型高效液相仪（美国Waters公司）；PHSJ-4A型实验室pH计（上海精密科学仪器有限公司）；Tomos Model2-16A高速离心机（美国Tomos公司）。

1.3.2 药物溶出/吸收仿生系统 药物溶出/吸收仿生系统（闭合式）如图1所示，其核心部位由药物溶解室和扩散池两部分组成，药物溶解室置一磁力搅拌子和载药篮，出口部分安装有不锈钢筛网；扩散池部分，在供给室和接受室之间嵌合大鼠离体肠管，使得肠腔浆膜侧为供给室，肠腔黏膜侧为接受室，供给室和接受室中的介质分别是药物溶解液（pH=6.0）和接受液（pH=7.4）。

1.4 PNS 中 Rg1、Rb1、R13 种成分 HPLC 同时测定方法

1.4.1 HPLC色谱条件 色谱柱：Agilent TC-C18（4.6mm×150mm，5 μm），以（A）乙腈和（B）水为流动相进行梯度洗脱，流动相梯度0～10min为22%（A）；10～18min 为 55%（A）；18～30min 为 22%（A）。流速：1.0mL/min，检测波长：203 nm，柱温：30℃，进样量：20μL。

1.4.2 储备液的制备 精密称定80℃干燥至恒质量的 Rg18.06mg、Rb16.80mg、R16.72mg 对照品，置10mL容量瓶中，分别用甲醇制备成浓度为806、680、672μg/mL的储备液，待用。

1.4.3 专属性 以药物溶解液作为空白对照样品，用储备液配置混合浓度的Rg1、Rb1和R1做为对照样品，从扩散池的接收室中随机取样做为待测样品。样品分别经0.45μm的微孔滤膜过滤，按“1.4.1”项下条件测定。

1.4.4 线性范围 将上述储备液用流动相混合稀释制备成一系列浓度的标准溶液，按“1.4.1”项下条件测定峰面积，以Rg1、Rb1、R1的浓度为横坐标，以峰面积值为纵坐标进行线性回归。

1.4.5 准确度和精密度 精密称量Rg1、Rb1、R1对照品配制高中低3个浓度各3份，按“1.4.1”项下条件测定，准确度结果以R E（%）表示。上述溶液每日测定3次，连续测定3 d，计算日内精密度和日间精密度 RSD（%）。

1.4.6 稳定性考察 取实验PNS供试品溶液，按“1.4.1”项下色谱条件，分别于 0、1、2、4、6、8 h 测定室温下样品的峰面积，计算8h内峰面积的RSD（%）。

1.5 实验方法

1.5.1 药物溶出/吸收仿生系统法（闭合式） 肠管安装：Wistar大鼠实验前禁食不禁水12 h，颈动脉脱臼处死，立即沿着腹中线打开腹腔，剪下空肠（自幽门15 cm处开始）段约2 cm，放入平面皿中（内有预先氧气饱和的接受液），小心去除肠系膜和表面脂肪，用37℃氧气饱和接受液洗净。用眼科剪沿肠系膜将该段肠管剖开，立刻小心安装在扩散池中间，安装的肠管两侧通混合氧气（95%O2+5%CO2），整个实验过程中保持各缓冲液温度为37℃。

样品采集：使用图1装置进行实验，将药物粉末加至药物溶解室中开始实验，溶解的药物随药物溶解液流入药物扩散池，继而由恒速蠕动泵泵回药物溶解室，药物溶解液的流速由恒速蠕动泵控制在0.5mL/min；分别在 20、30、40、60、90、120、150、180、210、240min从接受室取150μL样品，同时补充150μL空白接收液，待测样品处理后按照“1.4.1”项下色谱条件测定。

1.5.2 实验分组 PNS单用组：PNS原料药投药量为 36mg；（PNS＋冰片）组：PNS 原料药 36mg，冰片用量 1.5mg/mL；（PNS＋CsA）组：PNS 原料药 36mg，CsA用量0.5μg/mL。

1.5.3 数据处理

其中：Qt为药物各时间的累积透过量；Ct为t时刻透过的药物浓度；V为接收室中加入接收液的体积，实验中为5.5mL[11]。

公式（2）中Qt为累积透过量；D为投药量。

在符合漏槽条件，即供给侧药物浓度是接受测药物浓度的10倍以上，化合物的表观渗透系数Papp可根据如下方程计算：

公式（3）中，dQ/dt为单位时间内药物转运量；C0为供给池中药物的浓度；A是转运或扩散的表面积，本次实验中大鼠离体小肠的表面积为（2.0×1.0）cm2；Papp单位以 cm/秒表示。

1.6 统计学方法 统计学处理采用SPSS 18.0软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果与结论

2.1 PNS（Rg1、Rb1、R1）HPLC 测定方法的验证

2.1.1 专属性 如图2所示，药物溶解液对PNS中3种成分色谱峰无干扰，3种成分能很好分离，互不干扰，专属性良好。

2.1.2 线性范围 PNS中Rg1、Rb1、R1系列浓度（X）-峰面积（Y赞）线性回归方程见表1，表明这3种成分均呈现良好相关性。

表1 标准曲线结果Tab.1 Resultsof standard curve

2.1.3 准确度和精密度 PNS中 Rg1、Rb1、R1的准确度RE%和日内、日间精密度RSD%结果见表2，表明该方法准确度、精密度均符合要求。

表2 准确度和精密度测定结果（n＝3）Tab.2 Accuracy and precision for thedeterm ination of Rg1,Rb1,R1（n＝3）

2.1.4 稳定性考察 PNS样品溶液中 Rg1、Rb1、R1在不同时间点峰面积的RSD为1.34%、1.26%、1.41%，表明PNS样品在8 h内稳定性符合要求。

2.2 DDASS法 按“1.5.1”项下实验法，取样分别测得各个时间点Rg1、Rb1和R1透过浓度，按“1.5.3”项下计算其累计透过量，结果如图3所示。

单用PNS时Rg1、Rb1和R1在DDASS体系中肠跨膜累积透过率分别是 （0.037±0.021）%、（0.032±0.010）%和 （0.011±0.003）%，均小于文献中报道DDASS体系跨膜透过百分率的界限值0.04%[3]；计算Rg1、Rb1和R1透过大鼠离体肠管的Papp结果如表3所示，3种成分大鼠肠管的表观渗透系数都小于界限值1×10-6cm/s[12-13]，综上表明该3种成分渗透性差，预测三七总皂苷在体内吸收差，生物利用度低。曾昭征等[14]在复方配伍对三七总皂苷生物药剂学性质的影响研究中也证实了这一点。

从图3（A）可以看出PNS与冰片配伍后提高了Rg1和R1的累积透过量；表3显示与冰片配伍后Rg1、Rb1和 R1的 Papp分别增大 2.4、2.2 和 2.7 倍，配伍组与 PNS 组比较，Rg1、Rb1、R1的 Papp值差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），表明冰片对PNS中3种主要成分的吸收均有促进作用，可以提高其生物利用度。从图3（B）可以看出PNS与CsA合用后，对3种成分的累计透过量没有显著影响，表3显示PNS和CsA合用后与PNS组比较，Rg1、Rb1和R1的Papp差异无统计学意义（P>0.05），表明CsA对这3种成分的吸收没有显著性影响，推测Rg1、Rb1和R1可能不是P-gp的底物。

表3 PNS与冰片配伍及CsA干预前后Rg1、Rb1、R1的Papp（n=3，±s）Tab.3 The Papp of Rg1,Rb1 and R1 after PNS compatibility with borneolor simultaneously used with CsA（n=3，±s）

表3 PNS与冰片配伍及CsA干预前后Rg1、Rb1、R1的Papp（n=3，±s）Tab.3 The Papp of Rg1,Rb1 and R1 after PNS compatibility with borneolor simultaneously used with CsA（n=3，±s）

注：配伍组与 PNS 组相比，*P<0.05，**P<0.01。

Papp×10-6（cm/秒）人参皂苷Rg1 人参皂苷Rb1 三七皂苷R1 PNS 组 0.49±0.09 0.07±0.03 0.58±0.04 PNS＋冰片组 1.17±0.08** 0.16±0.02* 1.57±0.50*PNS＋CsA 组 0.62±0.09 0.12±0.04 0.90±0.26组别

3 讨论

冰片促进吸收的机制可能有2种：一是冰片有类似CsA的作用，抑制细胞膜上P-gp的活性；二是冰片可以开放细胞间紧密连接[15-16]。CsA是P-gp的强抑制剂，通过抑制P-gp转运体的活性，从而促进P-gp底物的吸收。结合2.2分析，推测Rg1、Rb1和R1可能不受P-gp外排蛋白转运机制影响，PNS中Rg1、Rb1和R1可能主要通过细胞旁路转运机制被吸收。目前为止，研究者用不同的方法对PNS的药理作用、吸收特点、配伍规律等进行了研究，其中邓震亭等[8]用大鼠不翻转肠囊模型对R1吸收的研究，发现R1在大鼠肠道内的吸收有被动扩散性，R1可能不是P-gp的底物；冯亮等[10]研究表明R1和Rg1在大鼠胃肠道的吸收动力学，并考察常用的吸收促进剂对其吸收速率的影响，发现卡波姆和冰片对它们在小肠的吸收有显著促进作用；韩旻等[9]采用Caco-2细胞和动物等模型研究三七皂苷的口服吸收机制，发现三七总皂苷（包括Rb1和Rg1）的肠道吸收机制为单纯被动扩散，吸收过程不受细胞膜内P-gp和MRP外排载体的调控，PNS中其他成分对Rb1或Rg1的吸收特性无明显影响；以上结论与本实验结果吻合，因此DDASS系统可以评价PNS的膜透过性及体内吸收机制。

Amidon等[1]认为药物吸收程度受药物跨膜透过性和溶解性两个因素影响。体内模型存在耗时、耗力、耗资的缺点，不适合用于药物的高通量筛选。药典溶出实验模型可以用于药物体外溶出度的考察，但是不能同时评价药物的渗透性。He等[3-4]应用DDASS模型评价了速释制剂在体外透过-体内吸收之间的相关性，该模型不但可以同步评价固体制剂体外溶出-跨膜透过特征，而且考虑到辅料对药物吸收的影响。本研究应用DDASS模型探讨了PNS与冰片配伍的膜透过规律及吸收机制，与文献报告的结果一致，因此DDASS系统可以用于中药配伍规律及机制研究，为传统中药体内过程研究提供新技术和新方法。

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Studieson the com patibility principlesof panax notoginseng saponinswith borneolusing a novelsimulating system

GUHui1,MA Ye-tao1,XUNMing-jin1,SHIXiao-yan1,HEXin1,2
（1.Faculty ofChineseMateriaMedica,Tianjin University of TCM,Tianjin 300193,China；2.Tianjin State Key Laboratory ofModern ChineseMedicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]The threemain componentsofpanax notoginseng saponins(ginsenoside Rg1,Rb1and notoginsenoside R1)asquality control components,using a drug dissolution/absorption simulating system to study the change of themembrane permeability of panax notoginseng saponinsafter compatibilitywith borneoland study itspossiblemechanism.The system willbe used to study traditionalChinesemedicine,to provide a newmethod for the developmentof traditionalChinesemedicine.[Methods]HPLCmethod wasestablished todetermine the threemain constituentsofPNS(ginsenosideRg1、Rb1and notoginsenosideR1)simultaneously.DDASSwasused tostudy the changesofcumulativepermeation amountand theapparentpermeability coefficients(Papp)ofPNSaftercompatibilitywith borneol.Variance analysiswas used to analyze the differencesbetween themean values of Pappby SPSS.[Results]Pappvalues ofginsenoside Rg1,Rb1and notoginsenoside R1respectivelywere(0.49±0.09)cm/s,(0.07±0.03)cm/s,(0.58±0.04)cm/s,and itwas significantly increased after compatibilitywith borneol2.4、2.2 and 2.7 times,respectively(P<0.05).The PappvaluesofRg1,Rb1 and R1 after compatibilitywith CsA were(0.66±0.07)cm/s,(0.14±0.05)cm/s,(0.92±0.27)cm/s.Therewere no significantdifference(P>0.05)compared with PNSgroup.[Conclusion]Borneolcan increase themembrane permeability of the PNS(ginsenoside Rg1,Rb1and notoginsenoside R1),and itcan promote PNSoralabsorption and enhance itsbioavailability.CsA doesnot improve the PNSmembrane permeability.Rg1,Rb1and R1maybe notthesubstrateofP-glycoprotein.Themechanism ofenhancingpermeationbyborneolmaybe influenceby theparacellular route transport.

ginsenoside Rg1;ginsenoside Rb1;notoginsenoside R1;Drug dissolution/absorption simulating system(DDASS);permeability coefficients(Papp)

R285.5

A

1672-1519（2012）03-0284-05

教育部“长江学者和创新团队发展计划”（PCSIRT，IRT0973）；天津市自然科学基金重点项目（12JCZDJC26100）；国家中医药管理局公益性行业专项（200807051）。

顾 慧（1983-），女，硕士研究生，主要研究方向为药物代谢动力学。

何 新。

2012-04-05）