中国患者华法林抗凝治疗剂量的药物基因组学相关性及药物基因组学方程的比较分析

王红娟，刘 瑜，杨 洁，徐 斌，李 泱，尹 彤

（中国人民解放军总医院老年心血管病研究所, 北京 100853）

华法林是防治血栓栓塞性疾病最常用的口服抗凝剂，但是其临床有效剂量存在很大的个体差异。随着遗传药理学的发展，现已证实编码华法林代谢和药效相关酶的基因的遗传多态性在很大程度上解释了华法林的个体差异和种族差异，包括细胞色素氧化酶P450（CYP）2C9、维生素K环氧化物还原酶复合体1（VKORCl）以及CYP4F2[1-3]。以遗传药理为基础的华法林药物基因组学剂量预测方程得到越来越多的关注，2007年美国食品与药品监督管理局更新华法林的处方，推荐用药前患者接受相关基因型检测[4]。但是，目前为止药物基因组学方程的验证全部都是在接受传统强度抗凝治疗（目标 INR为 2至 3）的患者中进行，而大多数的中国患者常规接受低强度华法林治疗[5]。研究显示，除种族因素外，方程的预测效果同样受华法林剂量影响[6]。因此，本研究在一个接受低强度治疗的中国患者队列中评估遗传因素和药物基因组学方程的预测效果与华法林剂量的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象

中国人民解放军总医院自2008年1月至2011年 7月连续收治的 282例中国患者。男性 140 例（49.6%），女性 142 例（50.4%），平均年龄（56.36±15.70）岁。接受抗凝治疗的主要原因分别为房颤（85例，30.1%）、瓣膜置换术后（138例，48.9%）、深静脉血栓形成/肺栓塞（45例，16%）以及其他（14例，5%）。入选标准包括因各种原因目前正在接受稳定剂量华法林抗凝治疗，目标INR为1.6～2.5，且初次用药日期明确。稳定华法林剂量定义为连续3次（每次间隔至少一周）实验室检查证实INR维持目标范围的剂量。临床信息收集自住院和门诊病历记录。患者存在严重肾脏、肝脏、血液系统疾病，恶性肿瘤，医疗信息不全，目标INR在1.6～2.5之外，血压超过180/110 mmHg，以及妊娠或哺乳期均排除。根据实际华法林使用量人群分为三个不同剂量组。包括低剂量（≤1.5 mg/d），中间剂量（≥1.5 mg/d，且≤4.5 mg/d）和高剂量（≥4.5 mg/d）。所有患者于参加研究前均需签署知情同意书。研究方案经伦理委员会批准。所有患者于参加研究前均需签署知情同意书。研究方案经伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 基因型测定 采集外周血提取基因组DNA。多重 SNaPshot SNP分型技术检测 CYP2C9*3(rs1057910)、VKORC1-1639 G/A (rs9923231)以及CYP4F2*3 (rs2108622)基因多态性。主要仪器包括东胜•龙（EDC-810）PCR仪（北京东胜创新生物科技有限公司），ABI 3730自动测序仪（美国ABI公司）。主要试剂包括Taq酶、SAP酶和ExoI酶（均为 Fermentas公司），Snapshot mix（美国 ABI公司）。每个变异位点的上下游引物和延伸引物分别为（1）CYP2C9*3，上游引物：5¢ TCAGCTAAAGTCCAGGAAGAG 3¢，下游引物：5¢ AACATGGAGTTGCAGTGTAGG 3¢，延伸引物：5¢ TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCACGAGGTCCAGAGATAC3¢；（2）VKORC1-1639 G＞A，上游引物：5¢GCTTGTCTTAAACTCC 3¢，下游引物：5¢TGAGAAACAGCATCTGGAGAG 3¢，延伸引物：5¢TTTTTTAGGCGTGAGCCACCGCACC3¢；（3）CYP4F2*3，上游引物：5¢ GAGACCAAGAAGGGTTGTTG 3¢，下游引物：5¢ TCTGCCTCATCAGTGTTTTCG 3¢，延伸引物：5¢TTTTTTTTTTTTTTTTACCTCAGGGTCCGGCCA CA3¢。参照序列为来自 GenBank的 CYP2C9、VKORC1和 CYP4F2基因组序列（NC_000010.8，NC_000016.9和NC_000019.9分别为）。所有参与研究的患者均签署遗传分析同意书。

1.2.2 文献检索和方程选择 检索PubMed自2004年1月至2011年9月报道华法林剂量预测方程的研究或综述。采用的MeSH包括：“warfarin”，“genetic polymorphism”，“CYP2C9”，“VKORC1”，“CYP4F-2”，“pharmacogenetics”，“pharmacogenomics”以及“single nucleotide polymorphisms”。所选的方程必须同时包括临床因素和遗传因素，而后者必须涉及CYP2C9和VKORC1这两个基因。排除建立于少于100人的队列的方程，以及包括一些在本研究队列中未予评估的因素（如血白细胞计数、维生素K摄入情况）和本研究中未分型的基因（或其等位基因）多态性的方程。

1.2.3 预测效果评估 预测效果评估指标包括平均绝对误差（MAE）和计算预测剂量在实际稳定剂量20%范围内的患者比例（20%界限内的比例）。MAE定义为方程计算值与实际值间绝对差异的均数。而后者为其他研究中使用过的具有临床意义的范围[6]。分别采用各方程计算每位患者的预测剂量。如果方程包含一个非-1639G/A的 VKORC1多态性，但是与-1639G/A呈强连锁不平衡，则使用-1639G/A。鉴于CYP2C9变异（如CYP2C9*2或*11）在亚洲人群中不存在或非常罕见，在相关方程中均定义为CYP2C9*1。

1.3 统计学处理

定量资料以均数±标准差表示，定性资料用百分率表示。采用卡方检验评估每个基因的Hardy-Weinberg平衡偏离度。平均治疗剂量与基因型的关系采用单向ANOVA检测评估。统计分析采用SPSS 19.0 软件。

2 结 果

2.1 基因型分析

全部队列患者中 CYP2C9*3基因*1/*1型 251例（89%），*1/*3型29例（10.3%），*3/*3型2例（0.7%）；VKORC1-1639基因AA型239例（84.8%），AG 型 40例（14.1%），GG型 3例（1.1%）；CYP4F2*3基因CC型为156例（55.3% ），CT型109例（38.7%），TT型17例（6.0%）。

2.2 基因组与华法林剂量的相关性

全部队列的实际华法林剂量为（3.00±1.09）mg/d。各基因的多态性均达到 Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），样本具有群体代表性。华法林剂量在各基因的变异基因型中均具有统计学意义的差异（CYP2C9*3：P＜0.001；VKORC1-1639 A/G：P＜0.001；CYP4F2*3：P＝0.025；图 1）。

2.3 不同剂量患者中药物基因组学方程的预测效果

选取了8个符合条件的药物基因组学方程（表1）。各方程对不同剂量范围患者的预测效果存在差异（表 2）。来自白种人群和混合人群的方程在高剂量（≥4.5 mg/d）人群中预测效果更好（20%界限内的比例：46.4%～57.1%)。而来自亚洲人群的方程则在中间剂量（1.5～4.5mg/d）患者中预测效果更好。入选的方程在低剂量患者中预测效果均不佳，20%界限内的比例均低于10.0%。

3 讨 论

本研究在一个282例接受低强度稳定剂量华法林抗凝治疗的中国患者队列中，证实 CYP2C9*3、VKORC1-1639 A/G和CYP4F2*3基因的多态性均与华法林剂量相关，已发表的药物基因组学方程对华法林剂量预测的准确性因患者实际华法林剂量不同而存在差异。来自白种人群和混合人群的方程对高剂量（≥4.5mg/d）患者的预测效果更好，而目前尚无方程可以很好的预测低剂量（≤1.5mg/d）患者的剂量。

本研究与既往在中国患者中进行的研究一致，均证实 CYP2C9 和 VKORC1基因多态性与华法林剂量相关。其中华法林剂量在CYP2C9 1*/1*个体中最高、而3*/3*最低，而华法林维持剂量在VKORC1基因 GG型最高、而AA型最低。白种人群的研究显示，VKORCl的多态性可以解释华法林用药剂量三分之一的遗传因素影响，联合CYP2C9可以用来解释半数患者之间的个体差异[5]。但与白种人群相比，亚洲人群中VKORC1和CYP2C9对华法林剂量差异的贡献相对较小。CYP4F2*3（rs2108622）为华法林剂量的第三个预测基因，相关研究较少。本研究证实其多态性与华法林剂量也显著相关。既往一项中国患者队列的研究显示其可解释 4%的稳定华法林剂量差异[13]。由于亚洲人群中华法林剂量的差异很大程度上取决于人口次要等位基因上相关多态性的发生率，在这种情况下，CYP4F2*3对亚洲患者华法林剂量的影响尽管较小，仍不应被忽视。

图1 CYP2C9*3, VKORC1-1639 A/G和CYP4F2*3与华法林治疗剂量的关系Figure 1 Correlationship of CYP2C9*3, VKORC1-1639 A/G and CYP4F2*3 with warfarin dose

表1 入选进行效果评估的方程Table 1 Pharmacogenetic algorithms selected for predictive accuracy evaluation

表2 药物基因组学方程对不同剂量患者的预测效果Table 2 Performance of pharmacogenetic algorithms in patients receiving different doss of warfarin

除种族因素外，华法林剂量也影响药物基因组学方程的预测效果。有报道药物基因组学方程在接受低剂量（≤3mg/d）或高剂量（≥7mg/d）患者中预测效果最好[19]。本研究中来自白种人群和混合人群的方程在高剂量（≥4.5mg/d）患者中预测效果更好（达20%界限的患者比例：46.4%～57.1%）。考虑白种人群中的平均剂量（5mg/d）高于亚洲人群（3mg/d）[4]，因此，来源于白种或混合人群的方程在高剂量人群中的预测效果优于来源于亚洲人群的方程也是合理的。在我们的研究中，来源于最广泛种族人群的国际华法林药物遗传学协会（IWPC）方程在中剂量（≤3mg/d）患者中达20%界限的患者比例为29.0%，而在≤2mg/d患者中为8.2% 。该结果与IWPC方程在其确认队列中的效果相当，≤3 mg/d的患者中为33.0%，2mg/d的患者中为15.4%[6]。数据显示药物基因组学方程对接受低剂量治疗的患者的预测准确性有限，可能为如下原因。首先，大多数已发表的药物基因组学方程均来源于目标INR为2～3的人群，因此这些方程无法对上述INR范围外的剂量给予清晰地预测[2,6,9-12]。其次，可能存在其他的遗传或非遗传因素以解释亚洲人群适合低剂量华法林治疗[14]。这也可能是本研究中即使是来自亚洲人群的方程，对低剂量组的预测效果也仍然不佳的原因。

我们的研究提示，目前没有一个符合条件的方程在采用低强度抗凝治疗的患者中于全部剂量范围表现最好的预测效果。因此，如何提高药物基因组学方程在低剂量患者中的预测效果，仍需进一步研究。

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