HSP70在胃癌中的表达及意义

尚进才 刘伟新 焦成斌

佳木斯大学附属第一医院普外科，黑龙江省佳木斯市 154002

热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是细胞受到刺激后产生的蛋白质，它高度保守。实验证实HSP在某些肿瘤组织中的表达与在正常组织中的表达不同［1，2］，如在卵巢癌中的表达与其临床病理分期和术后生存有关［3］，证实其是存在于肿瘤与正常组织间的一种差异蛋白［4］。本实验采用免疫组化法、组织芯片技术及RT－PCR法研究HSP70在胃癌、癌旁组织、胃炎组织和正常组织中的表达，并研究其与临床资料间的关系，为胃癌的发展和预后提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 组织芯片标本为佳木斯大学附属第一医院手术切除、经病理诊断证实为胃腺癌组织、距胃癌组织边缘1.5cm处的组织、距胃癌组织边缘5cm以上的正常胃黏膜组织及胃炎组织标本60例，用组织芯片制作仪细针打孔，制作组织芯片。在术前这些患者均未接受任何抗癌治疗，男43例，女17例。本组患者平均年龄（60±12）岁（中位年龄60.5岁，33～81岁）。RT－PCR组织标本也来自该院病理科提供的10例胃癌患者，及对应的癌旁组织、胃炎组织和正常胃黏膜组织。根据Lauen分类法（1965年）将肿瘤分类：60例中，肠型20例，弥漫型40例。按照肿瘤的分化分三类：高分化4例，中分化10例，低分化46例。根据国际抗癌联盟（UICC）1987年公布的胃癌TNM分期法将肿瘤分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期19例，Ⅲ期20例，Ⅳ期10例。17例阳性患者淋巴结阴性，43例阳性患者淋巴结阳性（N127例，N216例）。在检查的60例中有3例远处转移。所有标本经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm厚切片。

1.2 方法

1.2.1 制作组织芯片：HE染色切片，行病理诊断，标记病变组织范围。新鲜肿瘤组织经石蜡处理后，按照实验目的设计组织芯片阵列的组织类型和排列方式；在组织数据库中选择合适的组织病例编号；按照组织病例编号从组织库中取出组织蜡块和对应的HE染色切片；用组织包埋机制备合适的空白受体蜡块；用组织阵列仪按照阵列设计抽提病理蜡块组织芯并有规律地排列在空白受体蜡块上；将组织阵列块置于52℃的恒温烤箱中进行加热融合，使组织芯与受体蜡块紧密相连；用直径1mm的打孔针，在全自动组织切片机上以20μm/min的进刀速度对组织阵列块进行蜡块修整，直至80%的组织芯完全暴露。在全自动组织切片机上以4μm/min的进刀速度对组织阵列块进行切片；将切片裱附于防脱片处理的载玻片上；将阵列切片置于60℃恒温烤箱中加热16h；按编号，每隔10张组织芯片抽取一张进行HE染色；对抽检组织芯片中的每一个组织样本进行复诊质检；组织芯片实验白片保存于切片盒中，置于5℃冰箱保存；对使用过的病理组织蜡块进行封腊，并将其和对应的HE染色切片归位放回蜡块柜和切片盒中。

1.2.2 免疫组织化学染色：ElivisionTMplus试剂盒将多个抗鼠和抗兔IgG分子与辣根过氧化物酶聚合，所形成的聚合物直接与一抗结合，从而放大了抗原抗体结合的信号。其染色步骤如下：（1）芯片脱蜡和水化。（2）根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行柠檬酸修复液（pH值6.0）热修复20min。（3）每张切片加1滴或50μL 3%过氧化氢溶液，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗3×3’。（4）甩去PBS液，每张切片加1滴或50μL的第一抗体，室温下孵育60min或4℃过夜。（5）PBS冲洗3×5’。（6）甩去PBS液，每张切片加1滴或50μL聚合物增强剂（试剂A），室温下孵育20min。（7）PBS冲洗3×3’。（8）甩去PBS液，每张切片加1滴或50μL酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30min。（9）PBS冲洗3×3’。（10）甩去PBS液，每张切片加2滴或100μL新鲜配置的DAB显色液，显微镜下观察3～10min，阳性显色为棕色或红色。（11）蒸馏水或自来水冲洗，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，PBS冲洗返蓝。（12）用DAB显色，切片经过梯度酒精脱水干燥，中性树胶封片。染色结果判断：（1）阳性染色细胞是通过在每种条件下都由两个独立的观察者在不知全部观察者所认同的临床数据的情况下所获得的。（2）阳性结果判定：免疫组化的阳性表达均为各自染色条件下结构完整、定位明确、染色对比清晰，以细胞浆出现棕黄色染色或伴有胞核棕黄色颗粒的细胞。（3）切片在200倍镜下观察5～10个视野，每个视野计数100～200个肿瘤细胞，共计1 000个细胞，根据阳性细胞表达率分为：阴性为无着色细胞、背景同阴性对照或者阳性细胞率＜5%；阳性为细胞呈棕黄色和/或阳性细胞率为≥6%。

1.2.3 RT－PCR 检测：用 Trizol法提取组织总RNA，用紫外分光光度计在260和280nm处测定吸光度D值，计算RNA含量和纯度，按公式c＝（D260/D280）×稀释倍数/25计算 RNA 浓度。反转录总反应体积为20μL，包括 M－MLV5×reaction buffer 4μL、dNTP（10mmol/L）2μL、RNase inhibitor 0.5μL和 M－MLV RT 1μL，加水至20μL反应体系；反应条件：37℃60min，70℃加热10min灭活后冰上冷却；将获得的cDNA第一链产物置于－20℃保存，待行PCR扩增处理。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：HSP70（482bp）上游引物为5’－TGTTCGGAGTGGTTAGG－3’下游引 物 为 5’－TCTCATCGGATTTGGCAG－3’；βactin（182bp）上游引物为5’－GGAACTCGTGCGTGACATT－3’下游引物为5’－GGACGGAAGGCTGGAAGAGTG－3’。反应体系（20μL）包括 Taq酶0.2μL，dNTP（10mmol/L）0.2μL，上、下游引物各0.2μL，cDNA 0.1μL，10×Taq buffer 2μL，加ddH2O补充至反应体系达20μL。PCR反应条件：第一步，95℃预变性5min；第二步，95℃30s、55℃40s、72℃1min，共30个循环。4℃保存扩增产物，行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在紫外灯下进行观察，凝胶分析系统拍照。结果判定：目的基因相对表达水平＝（目的基因灰度值－背景灰度值）/（内参基因灰度值－背景灰度值）。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件对数据进行处理，各样本资料差异的统计学分析采用χ2检验、秩和检验及Fisher确切概率法。

2 结果

2.1 组织芯片及免疫组织化学检测结果 组织芯片由60（病例数）×4（胃癌组织、癌旁组织、胃炎组织及正常组织各取一点）组成。检测结果显示，HSP70主要在胃癌组织的细胞质中表达，细胞核及细胞膜上有少量表达；正常胃组织细胞中的表达水平较低（图1）。HSP70在胃癌组织的表达阳性率分别为75%（表1）。HSP70在胃癌中高表达，明显高于癌旁组织（P＜0.01）、胃炎组织（P＜0.01）和正常组织（P＜0.01）。

胃癌组织中HSP70的表达与患者年龄、性别、肿瘤组织类型和浸润胃壁深度无关（P＞0.05），与肿瘤分化程度、远处转移和临床病理分期具有相关性（P＜0.05），详见表2。

2.2 HSP70mRNA 的 RT－PCR 检 测 结 果HSP70mRNA在胃癌组织、癌旁组织、胃炎组织及正常组织中的表达量分别为（2.78±0.02）、（1.89±0.02）、（1.57±0.03）、（0.98±0.03），胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织（P＜0.001）、胃炎组织（P＜0.001）和正常组织（P＜0.001）。

图1 图中依次是HSP70在胃癌低分化、中分化、高分化及正常胃组织中的表达

3 讨论

组织芯片（tissue chip）又称组织微列方阵（tissue microarray，TMA），是将许多不同个体组织标本以规则阵列方式排布于同一载玻片上，进行同一指标的原位组织学研究，极大地提高了检测效率，目前已被广泛应用于肿瘤学研究的各个领域［5，6］。

本研究的免疫组织化学结果提示，HSP70在胃癌组织中的表达水平上调，但低于文献报道，可能与取材部位、检测手段和结果判定标准的不同有关。其在癌旁组织、胃炎和正常组织中的表达无明显差别，说明其与胃癌间具有的显著差异性。本实验采用RT－PCR技术对胃癌、癌旁组织、胃炎组织和正常胃黏膜组织中的mRNA表达进行了验证，其在胃癌组织中的表达明显升高与免疫组织化学结果一致，说明其转录和表达是一致的，说明其可能是通过参与胃癌细胞增殖的转录调控过程而在胃癌的发生中起某种作用。

总之，HSP70可能会成为一种肿瘤标志物。

［1］郭云鸿，田晓予，米建强，等.宫颈鳞癌组织中 HSP70和Bcl－2的表达及意义〔J〕.山东医药，2006，46（24）：11－12.

［2］栗军香，张瑞英，魏红，等.HSP70在急性白血病外周血细胞中的表达及临床意义〔J〕.山东医药，2007，47（17）：44－45.

［3］李琳，陈惠祯，张广平.热休克蛋白27表达与卵巢癌预后〔J〕.肿瘤，2001，21（4）：288－290.

［4］罗治文，朱樑，谢笑娟，等.胃癌及癌旁组织定量比较蛋白质组学研究〔J〕.中国生物工程杂志，2007，27（7）：55－60.

［5］邵志滨.组织芯片技术及其在胃癌研究中的应用〔J〕.国际病理科学与临床杂志，2007，27（3）：235－238.

［6］刘勇，路名芝.生物芯片技术及其在肿瘤研究中的应用〔J〕.江西医学检验，2002，20（6）：376－378.