Flavopiridol通过调节CDK4/CDK6/cyclinD1复合物表达抑制肝癌细胞增殖

车宇芳, 叶 飞, 张 泳, 姜 泊，吴本俨

（1解放军总医院南楼临床部消化内科, 北京 100853; 2美国西奈山医学院, 纽约 10029; 3南方医科大学附属南方医院消化内科, 广州 510515）

肝癌是成人最常见的一种肝脏恶性疾病，是目前世界上第五常见的实体肿瘤疾病, 并且高居癌症死亡的第三位[1]。尽管临床上有众多的肝癌治疗方法, 包括肝脏移植、外科切除、局部治疗, 但是仍有＞70%肝癌患者的预后不是很理想[2]。几乎85%肝癌患者在确诊时已经不能进行根治性治疗, 而只能给予保守治疗, 比如肝动脉插管化疗、射频治疗、化疗等[3]。耐受性好、效率高的治疗方法将是未来肝癌治疗发展的新方向[4]。

在肿瘤细胞中, 细胞周期素依赖激酶（cyclin dependent kinase, CDK）功能的失调控是一种常见的现象。鉴于这种原因, 影响CDK表达的化合物flavopiridol和其他一些新兴化学合成物得到了很好的发展[5]。Flavopiridol是来源于Amoora rohituka和Dysoxylumbinectariferum根茎的一种半合成黄酮类物质[6], 它可以有效抑制人癌细胞株中CDK1、CDK2、CDK4、CDK7的表达, 并且引起一系列细胞毒性, 导致细胞周期G1-S和G2-M期阻滞[7,8]。最近, flavopiridol对慢性淋巴细胞白血病治疗已经进入了Ⅱ期临床试验[9,10],但是关于其在肝癌治疗方面的报道却很少。本次研究目的在于了解flavopiridol是否可以影响肝癌细胞的增殖、凋亡和细胞周期, 从而为其将来应用于肝癌治疗奠定生物学基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料和试剂

细胞培养试剂DMEM细胞培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗均购自Invitrogen公司; flavopiridol购自Sigma-Aldrich公司; CDK4抗体, CDK6抗体,cyclinD1抗体, α-tubulin抗体购自Santa Cruz公司; 羊抗兔和羊抗鼠HRP抗体购自Bio-Rad公司; BCA蛋白检测试剂盒购自Pierce公司; 细胞计数试剂盒购自碧云天生物公司; 细胞周期试剂盒购自凯基生物公司; TACSTMAnnexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自R&D公司; 蛋白提取液购自Sigma公司;Super SignalRWest Pico Trial化学发光检测试剂盒购于Pierce公司, 细胞培养孔板均购自Corning公司;其余化学试剂均为国产分析纯和生物化学试剂。

1.2 细胞培养

肝癌Huh7细胞株购自ATCC细胞库, 为南方医院消化病研究所细胞培养室保存。细胞株37 ℃ , 5% CO2培养于含有10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基中。

1.3 细胞增殖分析

96孔板每孔加入Huh7细胞2000个/100 µl , 培养过夜后, 给予flavopiridol 150, 250, 350, 450, 550 nmol/L进行处理, 分别孵育 24, 48 h后, 每孔加入 10 µl CCK-8溶液, 在细胞培养箱内继续孵育1 h, 450 nm测定吸光度。实验设置3个复孔。

1.4 细胞凋亡分析

6孔板种植Huh7细胞, 培养过夜后使得细胞融合度达到 30%～50%, 给予 flavopiridol 150, 350,550 nmol/L, 处理24 h后收集细胞, PBS离心洗涤2次, 弃去上清, 将细胞沉淀悬于 200 µl Annexin-VFlous标记液中, 并转移到流式细胞仪试管中, 室温下避光孵育 15 min, 流式细胞仪收集细胞。运用CellQuest Program进行细胞凋亡分析, 实验重复3次。

1.5 细胞周期分析

6孔板种植Huh7细胞, 培养过夜后使细胞融合度达到30%～50%, 给予flavopiridol 150, 350, 550 nmol/L,处理24 h后收集细胞, PBS离心洗涤2次, 弃去上清,于细胞沉淀中加入200 µl 碘化丙啶溶液混匀, 室温下避光孵育 30 min; 利用流式细胞仪进行样品收集,运用 CellQuest Program进行细胞周期分布的分析,实验重复3个复孔。

1.6 Western-blot检测

1.6.1 细胞总蛋白的提取和定量 对 Huh7细胞分别给予flavopiridol 150, 350, 550 nmol/L剂量处理, 处理后提取细胞蛋白; 应用 BCA法测定蛋白浓度。

1.6.2 Western-blot检测 5%脱脂奶粉/TBS-T稀释α-tubulin抗体（1︰1000）、cyclinD1抗体（1︰500）、CDK4抗体（1︰500）、CDK6抗体（1︰500）, 与PVDF膜4℃孵育过夜, TBS洗涤3×3 min, TBS-T洗涤2×3 min。加入相应二抗, 与PVDF膜室温孵育1 h, TBS-T洗涤3×5 min, TBS洗涤3×8 min。SuperSignalRWest Pico Trial化学发光检测试剂盒进行蛋白信号的检测。

1.7 统计学处理

所有结果均经SPSS12.0统计软件统计。细胞增殖、凋亡、周期实验采用单向方差分析方法进行比较, 方差不齐时用Welch校正。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Flavopiridol对Huh7细胞增殖的影响

Flavopiridol 150, 250, 350, 450, 550 nmol/L处理Huh7细胞24 h和48 h后, 结果显示, 随着flavopiridol处理剂量的增加, 细胞数目逐渐减少; 处理 24 h和48 h不同剂量组间差异均有统计学意义（P＜0.001）, 说明flavopiridol可以显著抑制Huh7细胞增殖（图1）。

2.2 Flavopiridol促Huh7细胞凋亡的作用

Flavopiridol 150, 350, 550 nmol/L处理Huh7细胞24 h后, 流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明,flavopiridol可以引起Huh7细胞发生凋亡, 凋亡细胞从空白对照组的2.65%升高到550 nmol/L剂量处理组的14.17%（P＜0.01; 图 2）。

2.3 Flavopiridol对Huh7细胞周期的作用

Flavopiridol 150, 350, 550 nmol/L 处理Huh7细胞 24 h后, 流式细胞仪检测细胞周期分布情况, 结果表明, flavopiridol可以引起Huh7细胞G1期阻滞,G1细胞从空白对照组51.06%升高到550 nmol/L剂量处理组的57.53%（P＜0.01; 图3）。

图1 不同浓度flavopiridol处理Huh7细胞不同时间点后对细胞增殖率的影响Figure 1 Huh 7 cells viability after flavopiridol treatments at different concentration and time points

图2 不同浓度flavopiridol处理Huh7细胞24 h后细胞凋亡情况Figure 2 Huh7 cells apoptosis after flavopiridol treatment at different concentration

图3 不同浓度flavopiridol处理Huh7细胞24 h后的细胞周期分布情况Figure 3 Cell cycle distribution of Huh7 cells after flavopiridol treatment at different concentration

2.4 Flavopiridol抑制细胞CDK4, CDK6和cyclinD1表达

Flavopiridol 150, 350, 550 nmol/L处理Huh7细胞后收集细胞, 提取蛋白, Western blot方法检测CDK4、CDK6和 cyclinD1的表达情况。结果表明,flavopiridol可抑制CDK4, CDK6和cyclinD1表达, 并且呈现剂量依赖效应, 表明flavopiridol可能是通过下调CDK4, CDK6和 cyclinD1表达而引起细胞G1期阻滞, 从而抑制Huh7细胞增殖（图4）。

3 讨 论

肝癌是世界上最常见的癌症之一, 每年大约有50万到 100万患者死于肝癌[11]。虽然外科手术切除和肝脏移植被视为根治性的治疗方法, 但是80%肝癌患者在确诊时病灶已经扩散, 不能进行外科治疗[12]。所以, 进行有效的化疗, 是提高肝癌患者预后的重要方法之一; 而研发新的、有效的化疗药物将是未来肝癌治疗发展的方向。

图4 不同浓度flavopiridol处理Huh7细胞24 h后CDK4,CDK6, cyclinD1的表达Figure 4 Protein level of CDK4, CDK6 and cyclinD1 in Huh 7 cells after flavopiridol treatment at different concentration

Flavopiridol, 是一种半合成黄酮类物质, 可以在许多人类癌细胞株中引起细胞G1-S期和G2-M期阻滞, 在慢性淋巴细胞白血病治疗方面已经进入了Ⅱ期临床实验[7-10]。但是, 对于flavopiridol是否可以应用于肝癌患者的治疗仍不是很清楚。在本研究中,应用flavopiridol处理Huh7细胞, 观察其对细胞生物学特性的影响, 可为未来肝癌治疗提供新的方向。

本次研究提示, 应用 flavopiridol处理 Huh7细胞株, 可剂量依赖性抑制肝癌细胞增殖; 细胞凋亡和周期检测显示, flavopiridol处理Huh7细胞后, 可显著引起细胞凋亡和细胞周期 G1期阻滞, 这与近来flavopiridol可引起细胞凋亡和G1期阻滞的研究一致[13,14]; 另外, 在 flavopiridol处理 Huh7细胞后,我们进行了细胞周期G1期相关蛋白CDK4, CDK6和cyclinD1表达检测, 结果发现, flavopiridol可以抑制CDK4, CDK6, cyclinD1的蛋白表达。

总之, 本研究证明, flavopiridol可能通过抑制肝癌细胞 CDK4/CDK6/cyclinD1复合物表达水平,引起细胞G1期阻滞, 同时促进细胞凋亡, 从而抑制了肝癌细胞的增殖。未来可以将flavopiridol应用于肝癌患者治疗的生物学研究当中, 进而为肝癌治疗提供新的发展方向。

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