单核细胞趋化蛋白-2518G/A基因多态性与冠心病的关系

杨丽霞, 郭瑞威, 齐 峰, 王先梅, 郭传明, 任 丽, 徐安妨

（成都军区昆明总医院心血管内科, 昆明 650032）

炎症反应在冠心病发病中起着重要作用, 它不仅贯穿于冠状动脉粥样硬化（arteriosclerosis, AS）的全过程, 也是内在和外在危险因素导致、尤其是斑块不稳定发生破裂的中心环节。单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotaxis protein-1, MCP-1）在动脉粥样硬化炎症反应中发挥有重要作用, 它对动脉粥样硬化炎症反应的特征性细胞-单核/巨噬细胞的迁移和激活起特异性的调控作用。MCP-1还在多种细胞尤其是构成AS病变的 3种主要细胞——单核细胞、内皮细胞、平滑肌细胞中表达, 直接或间接地参与了动脉粥样硬化的形成[1]。本文旨在研究冠心病患者外周血MCP-1-2518 G/A基因多态性在各类冠心病病变中的变化, 探讨它在冠心病尤其是急性冠脉综合征（acute coronary syndrome, ACS）发病中的调控作用。

1 对象与方法

1.1 对象

选择2009年1月至2009年10月在成都军区昆明总医院心内科住院行冠状动脉造影（coronary angiography, CAG）的患者360例, 分为ACS组180例、稳定型心绞痛（stable angina pectoris, SAP）组120例和对照组60例。ACS组包括急性ST段抬高型心肌梗死60例、非 ST段抬高型心肌梗死60例和不稳定型心绞痛（unstable angina pectoris, UAP）60例。对照组为CAG结果正常者。急性心肌梗死、UAP、SAP诊断均符合 AHA/ACC诊断标准, 且经CAG检查至少有一只血管病变狭窄程度≥50%,UAP病例同时行心脏血管造影（computed tomography angiography, CTA）检查病变为软斑块（CT值小于50Hu）。排除合并脑卒中、严重肝肾功能不全、感染、自身免疫疾病、哮喘及肿瘤患者。

1.2 标本处理

ACS患者急诊入院时即刻采血, 其余于入院次日清晨空腹12 h采血, 抗凝管取静脉血3 ml, 3000 r/min离心10 min, 分离血清于-80℃冰箱冻存待测。同时采肘静脉血采用全自动生化仪测定总胆固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycerides, TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）, 以及红细胞、白细胞、血小板计数、纤维蛋白原、肝肾功能等生化指标。

1.3 冠状动脉造影

患者住院期间常规选择性或急诊冠状动脉造影检查, 冠状动脉狭窄程度的计算: 采用美国冠状动脉手术研究（Coronary Artery Surgery Study, CASS）诊断标准和Gensini评分标准[2], 狭窄≤25%为1分,25%～50%为2分, 50%～75%为4分, 75%～90%为8分, 90%～99%为16分, 100%（闭塞）为32分。不同节段冠状动脉评分系数按 Gensini标准, 狭窄程度评分再乘以一个标志病变位置, 在冠脉树中重要性的参数左主干×5; 左前降支近段×2.5; 中段×1.5; 远段×1; 第一对角支×1; 第二对角支×0.5; 左回旋支近段×2.5, 远段和后降支、钝缘支均×1, 后侧支×0.5; 右冠近、中、远段和后降支均×1, 每例患者冠状动脉病变程度的最终积分为各分支积分之和。

1.4 MCP-1基因多态性检测

（1）基因组DNA的制备。抽取研究对象外周冻存静脉血, 严格按照 DNA提取试剂盒（Tiangen公司，北京）说明书操作。（2）基因组DNA的扩增、酶切。目的基因片段PCR扩增引物序列[3]:上游引物:5-'CCGAG- ATGTTCCCAGCACAG-3', 下游引物:5-'CTGCTT- TGTTTGTGCCTCTT-3'。反应体系为 25 µl,其中模板 DNA 200 ng, dNTPs 600µmol/L, 引物各10pmol,Taq酶 0.7 U, 10×Buffer 2µl, 适量的灭菌ddH2O。反应条件: 94℃预变性5 min, 然后按94℃变性1 min, 55℃退火1 min, 72℃延伸1.5 min, 重复35个循环,最后 72℃延伸 10 min。应用限制性内切酶PvuⅡ对PCR扩增产物在37℃下进行酶切1h。取6µl酶切产物在 2%琼脂糖凝胶上进行电泳, 以1000bpMarker为参照, 紫外灯下观察、拍照并分析其结果。

1.5 采用ELISA法测定MCP-1水平

试剂盒购自大连泛邦生物工程有限公司, 操作步骤按照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学处理

应用SPSS11.0软件进行统计分析, 计量资料用±s表示, 多组间均数比较用单因素方差分析（AVONA）法; MCP-1-2518G/A多态性分布及等位基因频率采用χ2检验, 用多元逐步回归分析法分析冠脉病变Gensini评分与各危险因素的关系。

2 结 果

2.1 MCP-1基因多态性分析

GG纯合子酶切为708 bp和222 bp两种片段;AG杂合子酶切后为930 bp、708 bp和222 bp三种片段; 若为 AA纯合子则因无酶切位点而仅显示930bp一种片段（图1）。

图1 MCP-1 2518位点PVU Ⅱ酶切图Figure 1 Digestion of MCP-1 2518 with Pvu Ⅱ

2.2 MCP-1基因多态及等位基因频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律

表 1结果表明, 各组间基因类型、等位基因频率不同, ACS组GG明显高于SAP及对照组（33.4%vs24.2%, 33.4%vs15.0%,P＜0.05）, AA型基因ACS组较 SAP组及正常对照组降低（31.1%vs43.3%, 31.1%vs51.7%,P＜0.05）, AG型基因三组间无统计学差异（P＞0.05）; ACS组G等位基因频率高于SAP组及对照组（51.1%vs40.4%, 51.1%vs31.7%,P＜0.05）, ACS组A等位基因频率分布较SAP组及正常对照组降低（48.9%vs59.6%, 48.9%vs68.3%,P＜0.05）。

表1 各组基因型及等位基因频率分布Table 1 Distribution frequency of genotype and allele in every groups

2.3 MCP-1各型基因MCP-1浓度比较

AA型、AG型GG型依次升高（P＜0.05）。见表 2。

表2 MCP-1各型基因间MCP-1浓度比较Table 2 MCP-1 concentration in every genotype(±s)

表2 MCP-1各型基因间MCP-1浓度比较Table 2 MCP-1 concentration in every genotype(±s)

注: MCP-1: 单核细胞趋化蛋白-1; LDL-C: 低密度脂蛋白胆固醇;HDL-C: 高密度脂蛋白胆固醇; FBG: 空腹血糖。与AA基因型比较, *P＜0.05; 与AG基因型比较, #P＜0.05

基因型 MCP-1(ng/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)FBG(mmol/L)AA 124±15 2.58±0.25 1.37±0.35 5.5±0.5 AG 136±18* 2.57±0.36 1.32±0.24 5.8±2.0 GG 153±22*# 2.62±0.35 1.35±0.18 6.0±2.2*

2.4 MCP-1-2518G/A基因多态与冠状动脉病变Gensini评分多元回归分析

以冠状动脉病变 Gensini评分为应变量, 以各危险因素为自变量进行多元逐步回归分析, 有四个因素进入回归方程, 依次为 HDL-C、LDL-C、空腹血糖、MCP-1基因类型, 结果示冠状动脉病变Gensini评分与 LDL-C、空腹血糖、MCP-1基因类型成正相关, 冠状动脉病变 Gensini评分与 HDL-C呈负相关, 详见表3。

表3 冠状动脉病变Gensini评分影响因素的多元回归分析Table 3 The multiple regression analysis of risk factors of Gensini score of coronary artery lesions

3 讨 论

冠心病的发病是一个多因素参与、多种细胞因子相互调控形成的复杂炎症反应导致的冠状动脉狭窄病变或斑块破裂引起的急性冠状动脉事件。其病变过程不仅受到外在生活方式、环境因素等的影响,同时还与自身遗传等内在因素密切相关, 众多研究显示基因多态性是参与冠心病发病的一个遗传因素,近期发现 MCP-1-2518G/A位点基因多态性与冠心病密切相关, Szalai等[4]研究318例冠心病患者得出-2518G/A的变异可能为冠心病易感发病的遗传危险因素。McDerotte等[5]也发现了该位点基因多态性与缺血性心脏病相关。Jemaa等[6]研究提示 MCP-1基因-2518G/A多态性与心肌梗死相关。我们对行冠状动脉造影 300例冠心病患者和 60例患者采用PCR-RFLP方法检测 MCP-1-2518G/A位点多态性,我们的研究显示, MCP-1-2518G/A基因多态性 GG型基因ACS组（33.4%）较SAP组（24.2%）及正常对照组（15.0%）升高; ACS组G等位基因频率分布（51.1%）较SAP组（40.4%）及正常对照组（31.7%）升高, 经χ2检验，P＜0.05。AA型基因 ACS组（31.1%）较SAP组（43.3%）及正常对照组（51.7%）降低; ACS组A等位基因频率分布（48.9%）较SAP组（59.6%）及正常对照组（68.3%）降低, 经χ2检验，P＜0.05。据此，我们认为GG型基因及G型等位基因与冠心病的炎症反应严重程度相关, GG型基因及G型等位基因在冠心病尤其是 ACS易损斑块炎症反应中发挥重要作用。

多元回归分析 MCP-1-2518G/A基因多态性与冠状动脉病变 Gensini评分相关性显示,MCP-1-2518G/A基因多态性与冠状动脉粥样硬化的狭窄程度呈正相关, 提示MCP-1及其-2518G/A基因多态性与冠心病炎症反应严重程度相关。MCP-1-2518G/A基因多态性参与冠心病发病的机制未见报道, 我们认为 MCP-1-2518G/A位点位于MCP-1启动子区域, MCP-1-2518G/A基因多态性为功能性的, 因此该位点基因的多态性可能通过参与MCP-1基因转录水平的调控参与冠心病的发病。在MCP-1的近端调控区存在GC盒子, -2518G/A位点位于 MCP-1启动子近端调控区, 我们认为 MCP-1基因-2518G/A位点的基因多态性将决定 MCP-1基因启动子GC盒, G等位基因形成MCP-1启动子区域GC盒, A等位基因则不能形成MCP-1启动子区域GC盒。而GC盒是在MCP-1启动子近端调控区上特异结合反式作用因子刺激蛋白 1（stimulatory protein 1,SP1）增强转录的结合位点。SP1是一种强有效的核转录激活因子[7,8], 细胞内丝裂原激活蛋白激酶（mitogen- activated protein kinases, MAPK）是SP-1上游信号分子[9,10]。MAPK/SP-1通过 GC盒子结合MCP-1基因激活转录表达MCP-1趋化因子。我们分别对 MCP-1基因-2518G/A位点产生的三种类型GG型较AG型及AA型的患者进行MCP-1浓度测定, 结果显示 GG型较 AG型及 AA型升高（P＜0.05）, 差异有统计学意义, 结果与预想相一致。

综上所述, MCP-1-2518G/A基因多态性与冠心病相关, 其可能通过增强MCP-1转录表达参与冠心病发病。

[1]Kusano KF, Nakamura K, Kusano H,et al. Significance of the level of monocyte chemoattractant protein-1 in human atherosclerosis [J]. Circ J, 2004, 68(7): 671-676.

[2]Gensini GG. A more meaningful scoring system for determining the severity of coronary heart disease [J]. Am J Cardiol, 1983, 51(3): 606.

[3]Rovin BH, Lu L, Saxena R. A novel polymorphism in the MCP-1 gene regulatory region that influences MCP-1 expression [J]. Biochem Biophys Res Commun, 1999, 259(2): 344-348.

[4]Szalai C, Duba J, Prohasakl Z,et al. Involvement of polmorphisms, in the chemokine systerm in the susceptibility for coronary artery disease(CAD). Coincidence of elevated Lp(a) and MCP-12518 G/A geneotype in CAD patients [J].Atherosclerosis, 2001, 158(1): 233-239.

[5]McDerotte DH, Yang Q, Kathiresan S,et al. CCL2 polymorphisms are associated with serum monocyte chemoattractant protein-1 levels and myocardial infarction in the Framingharm Heart Study [J]. Circulation, 2005, 112(8):1113-1120.

[6]Jemaa R, Rojbani H, Kallel A,et al. Association between the-2518 G/A polymorphism in the monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) gene and myocardial infarction in Tunisian patients [J]. Clin Chim Acta, 2008, 390 (1-2):122-125.

[7]Suske G. The Sp-family of transcription factors [J]. Gene,1999, 238(2): 291-300.

[8]Ryu S, Zhou S, Ladurner AG,et al. The transcriptional cofactor complex CRSP is required for activity of the enhancer binding protein Sp1 [J]. Nature, 1999, 397(6718):446-450.

[9]Kao YS, Fong JC. Endothelin-1 induces glut1 transcription through enhanced interaction between Sp1 and NF-kappaB transcription factors [J]. Cell Signal, 2008, 20(4): 771-778.

[10]Zu L, He J. Jiang H.et al. Bacterial endotoxin stimulates adipose Lipolysisviatoll-like Receptor4 and extracelluar signal-regulated kinase pathway [J]. J Biol Chem, 2009,284(9): 5915-5926.