引种互叶白千层茶树油有效抑菌成分辨析*

钟振声,袁裕泉,樊丽妃

(华南理工大学 化学与化工学院，广东 广州 510640)

互叶白千层茶树原生长于澳大利亚，从该种茶树枝叶提取的茶树油具有杀菌消炎[1-2]、修复皮肤轻微创伤的功效，是天然的护肤品。上世纪80年代后，植物源杀菌剂日益受到重视，茶树油产业得以迅速发展，我国广东、广西、云南等地从1993年起先后成功引种互叶白千层茶树[3]。

茶树油的品种会因气候、土壤条件等种植因素不同而发生变异，自然形成茶树油成分含量不同的新品种[4]。前期研究曾对广西玉林、广东从化和江西吉安不同地方引种澳大利亚互叶白千层茶树所产的茶树油进行化学成分分析，研究其化学差异性，并给出了抑菌效果试验评价[5]。然而，由于茶树油化学成分十分复杂，尚未能在茶树油有效成分与抑菌活性之间建立起相应关系。

本文采用分馏法将从不同种植地点采集的茶树油进行馏分分离，对各馏分的主要成分和抑菌活性作对比研究，试图确定抑菌性能与某些化学成分之间存在的对应关系，为茶树品种的选育和茶树油的开发利用提供参考依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试验用茶树油分别来自广西玉林、江西吉安和广东从化茶树种植基地，为水蒸气蒸馏法得到的精油。丙酮、氯化钠及氢氧化钠均为分析纯试剂；琼脂、牛肉浸膏、蛋白胨均为生化试剂。供试菌种大肠杆菌Escherichiacoli、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus购于广州工业微生物检测中心菌种库。

QP2010 型气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)，日本SHIMADZU公司； SPX-Ⅱ型生化培养箱，上海新苗医疗器械公司；XS-212型生物显微镜，南京江南永新光学公司；SW-CJ-1D型净化工作台，苏州净化设备公司；YX-280D型压力蒸汽灭菌锅，江阴滨江医疗设备公司；10 mm×7.8 mm×(6±0.1)mm型牛津杯，浙江宁海健民医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 茶树油分馏 采用实验室常规精密分馏装置，理论塔板数约90，对茶树油进行缓慢加热分馏。先用常压蒸馏得到较低沸点的前馏分，然后在0.006 3 MPa减压蒸馏，分别得到不同温度段的馏分。

1.2.2 GC/MS分析 用电子天平精密称取茶树油，用丙酮配制成浓度约为5 mg/mL 的样品溶液。采用气相色谱-质谱联用仪对茶树油进行定性定量分析[6]。

色谱条件：色谱柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；样口温度260 ℃；载气为高纯氦；柱流量1.0 mL/min；分流比100∶1；进样量1 μL；程序升温起始温度70 ℃，速率10 ℃/min，终止温度180 ℃。质谱条件：电离方式EI；电子能量70 eV；接口温度250 ℃；离子源温度200 ℃；溶剂延迟2 min；加速电压1.00 kV；扫描范围45～500 amu。

1.2.3 抑菌活性测定 采用牛津杯法测不同浓度茶树油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，以相同浓度的溶剂做对比实验。

用液体稀释法[7]测茶树油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度。用无菌φ=5%吐温-80配制一系列不同浓度的茶树油。量取4.5 mL无菌培养液于试管中，加入0.5 mL不同浓度茶树油，再加入104cfu/mL菌液50 μL，使得茶树油最终质量分数为分别2%，1%，0.5%，0.25%，0.125%，0.062 5%。细菌置37 ℃摇床24 h，真菌置27 ℃摇床24 h后，取20 μL涂板看菌生长情况。无菌生长即相应浓度为最小抑菌浓度。

2 结果与讨论

2.1 广西玉林茶树油抑菌成分的辨识

对广西玉林茶树油进行分馏操作，共得到5个馏分。分别作GC/MS检测，结果汇集于表1。

由表1可知，广西玉林茶树油的主要成分是1,8-桉叶素(72.49%)、苧烯(8.57)、α-松油醇(8.27%)和α- 蒎烯(3.96%)，而常规的特征成分4-松油醇、α-松油烯、γ-松油烯和异松油烯的质量分数分别不足1%，属于桉型茶树油[8]。该成分构成与国际标准ISO4730:2004各项指标差距甚远[9]。

选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为供试菌，研究广西玉林茶树油5种不同馏分的抑菌性能。抑菌圈直径和最小抑菌浓度试验结果如表2所示。

综合表1和表2试验数据，广西玉林茶树油的主要抑菌成分集中在170～180 ℃的馏分，对两种受试菌的最小抑菌浓度都只有w=0.125%，当w低至10%就有显著抑菌作用。该馏分当中1,8-桉叶素的w达到93.35%。其他成分含量很低，对抑菌作用的影响很小。而>180 ℃馏分中尽管4-松油醇和α-松油醇含量很高，但是1,8-桉叶素的含量只有170～180 ℃馏分含量的1/9，该馏分无抑菌效果。因此可以确认广西玉林茶树油的主要抑菌成分为1,8-桉叶素而不是4-松油醇和α-松油醇。而140～160 ℃馏分1,8-桉叶素的w为82.07%，但是并无抑菌效果。与同浓度未分离的广西玉林茶树油相比，分离之后抑菌效果比其稍差[10]，因此此茶树油的抑菌效果应该还有其他成分的协同作用。

表1 广西玉林茶树油各馏分化学成分分析结果

表2 广西玉林茶树油各馏分的抑菌圈直径和最小抑菌浓度

2.2 江西吉安茶树油抑菌成分的辨识

对江西吉安茶树油先常压分馏，然后在减压分馏下分别得到5个馏分。分别作GC/MS检测，结果汇集于表3。

表3 江西吉安茶树油各馏分化学成分分析结果

由表3可知，江西吉安茶树油的主要成分是1,8-桉叶素(20.17%)、α-松油醇(23.77%)、(+)-柠檬烯(16.22%)、1，4-桉叶素(10.50%)等。该成分构成与国际标准ISO4730:2004各项指标差距也比较大。

选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为供试菌，研究江西吉安茶树油五种不同馏分的抑菌性能。抑菌圈直径和最小抑菌浓度试验结果如表4所示。

综合表3和表4试验数据，江西吉安茶树油的主要抑菌成分集中在减压分馏130 ℃以下的馏分。前馏分主要含有1,8-桉叶素(23.80%)、柠檬烯(17.61%)、对伞花烃(11.28%)等。<110 ℃的馏分主要含有1,8-桉叶素(23.51%)、柠烯(24.98%)、对伞花烃(13.26%)和α-松油醇(6.73%)等。100～130 ℃馏分主要含有α-松油醇(37.37%)、1,8-桉叶素(17.65%)、柠檬烯(9.39%)和对伞花烃(7.54%)。

据报道，原产于澳洲的茶树油的主要成分是4-松油醇、γ-松油烯、α-松油烯和异松油烯等[11]，但在江西吉安茶树油各具有抑菌作用的馏分中，很少出现以上成分。表3中数据显示，从馏分(1)到馏分(5)，α-松油醇w依次是7.94%、6.73%、37.37%、59.97%、18.48%，前两者α-松油醇含量低而抑菌活性高，后两者α-松油醇含量高而抑菌活性低，不成比例。馏分(1)到馏分(3),4-松油醇的w依次是1.20%、1.10%、1.42%，4-松油醇含量很低而抑菌活性高；相反，馏分(4)4-松油醇的w为4.36%，比馏分(1)高3.6倍，可是却没有表现出多大抑菌活性。换句话说，江西吉安茶树油的抑菌作用不是4-松油醇、γ-松油烯、α-松油烯和异松油烯等物质引起的。

表4 江西吉安茶树油各馏分的抑菌圈直径(1)和最小抑菌浓度

值得留意的是1,8-桉叶素，在前三个馏分中w分别是23.80%、23.51%、17.65%，而正是这三个馏分表现出好的抑菌活性。后两个馏分1,8-桉叶素w只有3.54%和0，对应的抑菌活性非常低。1,8-桉叶素含量与抑菌活性之间表现出密切的关系。

2.3 广东从化引种茶树油抑菌成分的辨识

对广东从化引种茶树油进行分馏操作，共得到5个馏分，分别作GC/MS检测，结果汇集于表5。

选用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为供试菌，研究广东从化茶树油5种不同馏分的抑菌性能。抑菌圈直径和最小抑菌度试验结果如表6所示。

表6的实验数据表明，从化茶树油分馏后所得的馏分(1)～(3)具有好的抑菌活性，其中活性最高的是低沸点的前馏分(1)。

表5数据显示，从化茶树油的前四大主要成分是α- 松油烯、对伞花烃、γ-松油烯和4-松油醇，合起来占总量的52.2%～76.87%，见表7。其中馏分(3)四种主要成分的w合计76.87%，馏分(4)四种主要成分的w合计70.61%，两者差别很小，但是抑菌活性差别巨大。馏分(1)四种主要成分的w合计64.35%，比馏分(4)少，但抑菌活性却大得多。所以，从四种主要成分的组合看不出与抑菌活性的关联。

从单一成分看，抑菌活性与4-松油醇含量没有对应关系。前三个馏分4-松油醇含量低，w分别是18.76%、17.66%和22.56%，但抑菌活性好；后两个馏分4-松油醇含量很高，w分别是28.90%和36.95%，抑菌活性却很差。观察α-松油醇的含量与抑菌活性的关系，结论同上。对伞花烃对抑菌活性的贡献似乎也不占主导地位。馏分(3)含对伞花烃w=22.64%，抑菌活性不如含16.05%的馏分(2)；而含对伞花烃13.75%的馏分(4)并没有抑菌活性。从α-松油烯的数据同样看不出其对抑菌活性的贡献。由此可以认为，茶树油的抑菌作用与α-松油烯、对伞花烃、γ-松油烯和4-松油醇的含量没有直接关系。

茶树油的抑菌活性物质只能从非主要成分中寻找。其中最有关联度的是1,8-桉叶素[12]。馏分(1),(2),(3)中1,8-桉叶素含量w分别为6.83%、6.43%和6.44%，这三个馏分都表现出很好的抑菌活性；馏分(4)中1,8-桉叶素w为1.45%，比前三种馏分低得多，相应的抑菌活性也差得多，馏分(5)检不出1,8-桉叶素，也没有抑菌活性。

表5 广东从化茶树油各馏分化学成分分析结果(1)

表6 广东从化茶树油各馏分的抑菌圈直径(1)和最小抑菌浓度

表7 从广东化茶树油各馏分中主要化学成分的变化1)

3 结 论

广西玉林、江西吉安和广东从化三个地方出产的茶树油成分存在较大差异。广西玉林茶树油1,8-桉叶素w高达72.49%，4-松油醇w只有0.78%，属于桉型茶树油。广东从化茶树油的4-松油醇w为43.59%、1,8-桉叶素w只有2.14%，保留澳洲茶树油的成分特征，属于松油醇型茶树油。江西吉安茶树油是一种几乎不含4-松油醇，但α-松油醇w达到23.77%、1,8-桉叶素w提高到20.17%的茶树油，可能又是一种新类型。

虽然三种茶树油品种不同，但是对两种供试菌种都有较强的抑菌活性。广西玉林茶树油对大肠杆菌的抑菌圈直径达到21.66 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到22.33 mm；江西吉安茶树油对大肠杆菌的抑菌圈直径达到19.86 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到25.47 mm；广东从化茶树油对大肠杆菌的抑菌圈直径达到21.35 mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到26.51 mm。

实验数据表明,三种茶树油的有效抑菌物质都是1,8-桉叶素。而4-松油醇、γ- 松油烯、α-松油烯和伞花烯等物质对1,8-桉叶素的抑菌效果有协同作用。

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