孕中期羊水细胞培养及其在产前诊断中的应用

武其文，范含萍，江 峰，浦 春

(皖南医学院附属弋矶山医院 产前诊断中心1.检验科;2.妇产科;3.超声医学科，安徽 芜湖 241001)

染色体疾病是一种常见的遗传病，无论是染色体数目异常还是结构异常均可导致先天畸形、智力低下、流产、不孕、生长发育障碍等，是造成新生儿出生缺陷常见的原因［1］。应用胎儿脱落羊水细胞培养进行染色体核型分析是胎儿染色体病产前诊断的主要方法之一，但羊水细胞培养技术要求高、难度大、成功率不稳定。如何取得较高的羊水细胞培养成功率，是这项技术成功应用于临床的关键。我院产前诊断中心遗传室自2009年开展此项技术，针对羊水细胞培养技术进行了努力的探索和改良，经历了一段时间后取得了满意的效果，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2009年10月～2011年10月期间，因有产前诊断指征在我院接受羊水细胞培养产前诊断的孕妇共238例，年龄22～45岁，孕周16～30周(其中＞22周7例)。孕妇签署知情同意后实施羊膜腔穿刺术。孕妇产前诊断的指征包括:①孕妇年龄≥35岁;②孕妇曾经生育过染色体异常患儿史;③母血清生化筛查高风险;④超声检查发现胎儿异常;⑤夫妇一方有染色体结构异常者;⑥孕妇有原因不明的多次流产、死胎、死产史;⑦羊水过多或过少。

1.2 方法

1.2.1 羊膜腔穿刺采集标本 穿刺前嘱孕妇侧卧轻轻上下摇动腹部数次，常规下腹部皮肤消毒、铺巾，在B超引导下用一次性羊水穿刺针(21 G)经腹壁行羊膜腔穿刺术并抽取羊水。先用5 ml注射器抽取羊水2～3 ml弃去，再用20 ml注射器抽取羊水20 ml，立即送细胞培养室。

1.2.2 细胞培养 将20 ml羊水分装于两只15 ml无菌离心管(Falcon产品)中，1 000 r/min离心8 min，弃上清，保留每管1 ml，以滴管打匀，分别接种2个瓶口带滤膜的50 ml培养瓶(Falcon产品)的底部，拧紧瓶盖放置超净工作台中静止10 min，再沿培养瓶边缘缓缓加入AminoMAX羊水完全培养基(GIBCO产品)4 ml，使其覆盖细胞悬液，置37℃含5%CO2培养箱中培养。6 d后更换培养液并在倒置显微镜下每日观察细胞生长情况，直至收获。

1.2.3 细胞收获及制片 当显微镜下见贴壁生长的羊水细胞形成较大的克隆，并出现成对的圆形透亮细胞时，即可进行细胞收获。收获前加入20μg/ml的秋水仙素(湖南湘雅基因技术有限公司产品)3滴，使终浓度达到0.2μg/ml，作用2 h后，倒去培养瓶上清，加入0.25%胰蛋白酶(Sigma产品)2 ml，37℃水浴箱消化5 min，用细胞刮刀将贴壁细胞刮下，再用吸管反复吹打数次，将细胞悬液移入离心管，进行离心、低渗、固定等步骤，按本室常规方法染色体制片。

1.2.4 染色体G显带及核型分析 制备好的玻片，置75℃烤箱中烤片3 h，0.05%胰酶消化，Giemsa染色显带。按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN 1995)标准进行核型分析诊断。常规计数20个分裂相，分析5个分散良好的核型，异常核型加倍计数40个分裂相。

2 结果

2.1 细胞培养结果 238例孕妇的羊水细胞培养，一次羊膜腔穿刺即培养成功227例，成功率为95.4%。11例初次培养失败孕妇有4例进行了二次羊穿，全部培养成功，总成功率为97.1%。剩余7例培养失败中分析其原因，有1例为胎粪污染、4例细胞贴壁生长不良、2例孕周偏大(＞25周)。羊水细胞培养的时间最短6 d收获，最长10 d收获，大部分羊水细胞在培养第7天，可见较多的克隆贴壁旺盛的生长，是收获的最佳时机，见图1。

图1 羊水细胞培养第7天(10×20)Fig1 Amniotic fluid cells cultured for 7 days

2.2 染色体核型分析结果 在成功培养的231例羊水中共发现8例染色体异常，异常率占3.5%。其中发现21三体2例、18三体1例、Turner综合征2例、Klinefelter综合征1例、结构异常1例，嵌合体1例;另外，发现染色体多态性4例，分别为Yqh+2例，9qh+1例，16qh+1例。其余染色体核型均为正常。8例异常染色体结果及胎儿结局见表1。

表1 8例异常染色体核型分析结果及胎儿结局Tab1 8 cases of abnormal karyotype results and fetal outcomes

2.3 典型的染色体核型分析图 见图2、3。

图2 18三体染色体核型图(箭头所示为18号染色体，10×100)Fig2 Trisomy of18 karyotype map(the arrow shows the chromosome 18，10 ×100)

图3 21三体染色体核型图(箭头所示为21号染色体，10×100)Fig3 Trisomy of 21 karyotype map(the arrow shows the chromosome 21，10 ×100)

3 讨论

自1966年Steele首次报道羊水细胞培养成功并应用于临床胎儿染色体疾病的产前诊断以来，至今此项技术仍是产前诊断染色体病最安全、经济和有效的方法［2］。但羊水细胞培养是一项技术要求高、难度大、培养时间长、分裂相较少、成功率不稳定的实验项目［3－4］。我们在羊水培养过程中对标本采集、细胞接种、收获制片等环节做了一些探讨和改良，获得了较为满意的结果。238例羊水有231例培养获得成功，总成功率达97.1%。现将经验总结如下。

首先，在标本采集方面，羊膜腔穿刺是有创性操作，穿刺前应做好准备工作，穿刺时做到严格无菌，一旦被细菌污染，不仅导致培养失败，而且对孕妇和胎儿也会造成感染和流产的危险［5］。其次，在标本接种方面，我们做了以下的改良，20 ml羊水分成2管离心接种2个培养瓶，离心后留取较多的细胞悬液(1 ml)进行接种。由于羊水细胞在制取过程中容易丢失，我们把羊水细胞悬液直接接种于培养瓶底部，经过一段时间(10 min)静置后再加入培养基培养，使细胞提前集中贴壁，减少丢失，结果发现有效细胞克隆形成更早更多。这种改进不仅提高了培养的成功率，而且延长了羊水采集的孕周。一般认为，羊水标本采集在孕16～22周为宜，此时羊水中含有的活性细胞最多［6－7］。但我们的培养方法在 ＞22周羊水标本中也有5例获得了培养成功。最后，收获时机的把握是制得良好核型的关键。羊水细胞平均贴壁时间约为5～7 d，开始贴壁多见胎儿上皮样细胞及梭长形羊水细胞(AF细胞)，形成的细胞克隆覆盖1个或1个以上的完整视野进行换液，当培养瓶中有较多的细胞克隆，周边细胞生长旺盛，存在有较多的圆形或双圆形透亮细胞，为最佳收获时机。

231例羊水染色体核型分析共发现8例异常，异常率占 3.5%，异常率与国内有关报道相近［8－9］。发现染色体非整倍体6例，包括21三体2例、18三体1例、Turner综合征2例、Klinefelter综合征1例。染色体非整倍体是活产婴儿中发病率较高的染色体疾病，均会造成新生儿发生严重的出生缺陷。6例非整倍体婴儿，经验证和孕妇同意后均做了引产手术，有效地避免了非整倍体婴儿的出生。231例羊水分析还发现了染色体结构异常1例［46，XY，t(2p，7q)］以及嵌合体 1 例(46，XX/69，XXX)。染色体结构异常的胎儿来源于其父亲的平衡易位，并不引起遗传物质量的丢失。由于其父亲表型正常，经孕妇同意，该婴儿得以保留，出生后未见表型异常。羊水嵌合体的胎儿的处理需要谨慎［10］，本例经脐带血穿刺验证后为假性嵌合，胎儿出生后也未见异常。另外，我们还发现染色体多态性4例，分别为Yqh+2例，9qh+1例，16qh+1例，均为人类染色体的异态性，同样这些胎儿均予以了保留。通过对已娩出的新生儿电话随访，胎儿出生后均表型正常且性别完全吻合。

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