二氯化钴所致缺氧对A549细胞增殖抑制和凋亡的影响

陶绍能，周建国，程光华，杨继文，葛俊亮

(皖南医学院附属弋矶山医院 核医学科，安徽 芜湖 241001)

氧稳态的维持是细胞生命活动的基本前提，二氯化钴常应用于体外模拟细胞低氧环境，这与二价钴离子可诱导细胞中低氧诱导因子-1(hypoxia induced factor，HIF-1)及其调控基因的表达有关。HIF-1的活性主要由HIF-1α的活性所决定，是最重要的低氧信号转录调节因子［1］。在实体瘤的发展过程中，由于存在血管功能受损和血供障碍的问题，因此缺氧是无法回避的问题，缺氧的严重程度决定了肿瘤细胞是适应环境还是走向凋亡［2］。激活的HIF-1α可以影响下游基因的表达，从而影响肿瘤细胞的增殖。本研究从二氯化钴所致的缺氧诱导肺腺癌A549细胞凋亡和增殖的角度，初步探讨HIF-1α在缺氧环境下的表达及其与细胞凋亡和增殖的关系。

1 材料和方法

1. 1 材料与试剂 肺腺癌A549细胞株培养于RPMI 1640中，37℃、5%CO2孵箱中培养，取对数生长期细胞实验。新生牛血清(GIBCO，USA);RPMI 1640培养基(GIBCO，USA);CoCl2(上海生物工程技术服务有限公司)，DMS0(Amresco)，四甲基偶氮唑盐(MTT，Amresco)，Annexin V-FITC/PI双标记染色试剂盒(晶美公司)，二氧化碳恒温培养箱(英国Galaxy)，RT-PCR 试剂盒(invotrigen)，RT-PCR 仪(美国 BIO-RAD Mycycler)，凝胶成像系统为国产Tanon天能。美国BD FACSCantoII流式细胞仪。

1.2 细胞培养和传代 A549细胞于37℃、5%CO2混合气体和饱和湿度的培养箱中进行培养，生长培养基为 RPMI 1640完全培养基，含10%热灭活(56℃，30 min)的小牛血清、青霉素100 U、链霉素100 U，待细胞生长呈单层铺满瓶底时，用0.25%的胰蛋白酶和0.02%EDTA为1∶1的混合消化液消化传代。

1.3 细胞体外乏氧微环境的建立 将适量化学乏氧剂CoCl2溶于新鲜三蒸水，配制两种浓度的工作液，分别适用于96孔培养板和75 cm2培养瓶，分装入小玻瓶，高压蒸气灭菌，4℃冰箱保存。用于模拟肿瘤乏氧微环境。

1.4 MTT法检测A549细胞增殖 取对数生长期的A549细胞制成2×104个/ml细胞悬液，按每孔100μl细胞悬液接种96孔培养板中，每孔剩余的100μl空间用(100－n)μl补足，n为此孔之后加药量的μl数。37℃，5%CO2培养箱中培养12 h(细胞基本贴壁)后加入CoCl2工作液使终浓度为200 μmol/L，分别于 0、4、12、24、48 h 后终止。每一浓度设3个复孔，以不含CoCl2的RPMI 1640培养基细胞作为阴性对照，空白孔调零。继续培养，24 h后终止。每个待测孔加MTT(10 mg/ml)20μl，37℃继续培养，4 h后小心吸弃上清液，每孔加DMSO 100 μl，振荡10 min，酶标仪测定570/620 nm处吸光度(OD)值。根据OD值绘制细胞生长曲线，分别观察CoCl2作用不同时间对A549细胞生长的影响。

1.5 半定量RT-PCR检测HIF-1α mRNA的表达A549细胞按1×106个/瓶接种于100 ml培养瓶中，孵育12 h待细胞贴壁后加CoCl2使其终浓度为200 μmol/L，随后在CoCl2200μmol/L浓度的基础上，选取0、4、12、24和48 h进行观测。在指定的时间收集细胞用Trizol提取总RNA，用紫外分光光度计测定RNA纯度(A260/A280＞1.60)，同时进行 RNA定量。取2μg RNA经逆转录酶在下列条件下合成cDNA:70℃，5 min，42℃延伸 60 min，95℃酶灭活 3 min，4℃终止反应。然后用该cDNA作为模板进行PCR反应，PCR引物由Invitrogen公司合成。内对照β肌动蛋白(β-actin)引物序列:上游引物:5'-GTGGACATCCGCAAAGACCT-3'。 下游引物:5'-CGAAAGCAATGCTATCACCTC-3'，扩增646 bp;人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)引物(参照 Genbank:U22431)，上游引物:5'-TGTGAGTTCGCATCTTGATA-3'，下游引物:5'-TTCGCTGTGTGTTTTGTTCT-3'。扩增片段为350 bp，扩增条件如下:94℃预变性5 min，94℃变性 45 s、52.5℃退火 45 s、72℃延伸 60 s进行相应循环30次。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后拍照。

1.6 AnnexinV-FITC/PI双标记染色检测 A549细胞凋亡 采用Annexinv-FITC/PI双标记染色，流式细胞术检测以鉴别肿瘤样本中的活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。根据FITC/PI荧光作双数散点图，可获得由四个象限组成的双参数图。左下象限(left lower quadrant，LLQ)为活细胞，AnexinV-FITC(－)/PI(－);右下象限(right low quadrant，RLQ)为早期凋亡细胞，AnnexinV-FITC(+)/PI(－);右上象限(right upper quadrant，RUQ)为晚期凋亡细胞和坏死细胞，AnnexinV-FITC(+)/PI(+);左上象限(left upper quadrant，LUQ)为细胞收集过程中产生的损伤细胞，AnnexV-FITC(－)/PI(+)。每个象限的细胞数就是其受检总细胞数中所占的比例。

2 结果

2.1 缺氧对A549细胞增殖的抑制作用(见图1)相同浓度CoCl2(200μmol/L)不同的作用时间，经统计发现随着作用时间的延长有统计学意义(F=19.782，P＜0.01)，随着作用时间的延长，细胞抑制越明显，呈现明显的时效关系。从MTT的研究结果显示CoCl2对A549细胞的生长曲线与缺氧时间有负相关性(r=－0.790，P＜0.05)。说明同一浓度CoCl2随着作用时间的延长可明显抑制A549细胞增殖，表现出时间依赖性。

图1 200μmol/L CoCl2作用A549细胞不同时间对细胞生长的抑制作用

2.2 半定量RT-PCR检测HIF-1αmRNA的表达RT-PCR结果显示，未经CoCl2处理的A549细胞中HIF-1αmRNA水平很低，在200μmol/L CoCl2的作用下，随着CoCl2作用时间的延长，HIF-1αmRNA的表达量有不同程度的上调(F=195.414，P＜0.01。见图2)。CoCl2与 HIF-1αmRNA表达间表现出较好的时间依赖性(r=0.933，P＜0.05)。

2.3 流式细胞仪对A549细胞凋亡的检测 Annexin V和碘化丙啶染色后，正常的活细胞不被Annexin V和碘化丙啶染色;凋亡早期的细胞仅被Annexin V染色，碘化丙啶染色呈阴性;坏死细胞和凋亡晚期的细胞可以同时被Annexin V和碘化丙啶染色。流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示，常氧组细胞以正常活细胞居多，凋亡早期和凋亡晚期的细胞比率都很小;乏氧处理后，随着时间的延长，凋亡早期和凋亡晚期的细胞比率逐渐增加。正常对照组、4、12、24、48 h 组细胞凋亡率分别为(0.60 ±0.10)%、(1.10 ± 0.10)%、(8.63 ± 0.75)%、(12.80 ±0.85)%和(19.33 ±0.80)%(见图 3)。经统计，除正常对照组与4 h组无统计学意义外(P=0.351)，其他各组均有统计学意义(F=484.955，P＜0.01)。

图2 RT-PCR检测200μmol/L CoCl2处理A549细胞后不同时间HIF-1αmRNA的表达

图3 200μmol/L CoCl2处理A549细胞后不同时间细胞凋亡变化

3 讨论

实验性缺氧方法有两种，一种是在低氧环境中培养实验细胞或组织，也称为环境缺氧;另一种是在细胞或组织培养液中加入铁的螯合剂或CoCl2，阻断氧信号的转导，在细胞中模拟低氧信号转导，也称为细胞缺氧。环境缺氧方法由于需要特殊的培养设备和低氧浓度的混合气体，限制了其在实验中的应用。Co2+是铁螯合酶的底物，可替代氧感受器血红素中的Fe2+，在高浓度时与氧结合，将此分子锁定在脱氧合状态，使细胞在不缺氧的环境下“感觉”缺氧，并上调缺氧诱导因子的表达而增强细胞的抗缺氧潜力［3］。因此，CoCl2是一种比较好的化学缺氧诱导剂［4］，本研究中运用 CoCl2诱导 A549细胞缺氧。

低氧在恶性肿瘤包括肺癌的生长过程中是普遍存在的。肺癌的这种特殊微环境可以诱导多种基因表达发生改变，从而使肿瘤耐受放化疗，影响肿瘤的预后。HIF-1α是低氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，既往文献［5］提示，HIF-1α与低氧状态下细胞增殖有关。本研究采用MTT法测定A549细胞的生长曲线，结果表明随着CoCl2作用时间延长，低氧对A549细胞的增殖随CoCl2的作用时间延长而增强，表现出一定的细胞毒性，此源于一种对应激反应的激活。模拟低氧的直接表现是HIF-1α的蓄积增加，本研究对人A549细胞在乏氧条件下HIF-1αmRNA表达进行了研究，我们观察到，CoCl2作用时间与HIF-1αmRNA的水平上调具有时间相关性。随着CoCl2作用时间延长，HIF-1α mRNA水平明显增加。

本研究应用流式细胞术检测A549细胞经低氧培养后的凋亡率，发现低氧环境可诱导A549细胞的凋亡，且凋亡率随CoCl2的作用时间延长而增加，说明乏氧微环境的确在一定程度上可诱导细胞凋亡。但是有文献报道［6－7］，不同细胞在不同的实验条件下，HIF-1α表现出抗凋亡或凋亡作用，尤其是在严重或长时间低氧下，HIF-1α可诱导促凋亡基因的表达［8］。目前已知至少有2种信号转导途径与CoCl2诱导缺氧引发细胞凋亡有关:①通过细胞表面死亡受体通路［9］，如Fas、TNF-a介导的细胞凋亡;②线粒体通路［10］，并伴随Bcl-2家族成员表达而改变，其中促进细胞凋亡的蛋白有Bax、Bcl-xs等，抑制细胞凋亡的蛋白有Bcl-2、Bcl-xL等。本研究已经证明缺氧可以诱导A549细胞发生凋亡，但对缺氧诱导A549细胞发生凋亡的感受通路以及信号转导途径等有待进一步研究。

总之，CoCl2化学模拟低氧过程中伴随着对细胞增殖和凋亡的复杂影响，实际上化学性模拟低氧也仅仅是部分的与生理性低氧相吻合。本研究提示，在模拟低氧时CoCl2的作用时间应引起高度重视，CoCl2对A549细胞具有上调HIF-1αmRNA表达作用，可抑制细胞的增殖和一定的凋亡诱导作用，这些说明HIF-1α可能在肺癌的发展中扮演着重要的作用。

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［2］陈斌，顾蔚卿，倪健.雷帕霉素联合缺氧诱导肺腺癌A549细胞凋亡及其分子机制［J］.肿瘤，2010，30(4):293－297.

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［5］ARDYANTO TD，OSAKI M，NAGAHAMA Y，et al.Down-regulation of cobalt-induced HIF-1αlpha expression correlates with cell proliferation and apoptosis in human gastric carcinoma cells［J］.Oncol Rep，2008，19(2):339－343.

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