脑源性神经营养因子在孤独症模型鼠颞叶皮层中的表达①

陈淑娟，姜志梅，郭岚敏，张士岭，孙奇峰，李丽，王长山

脑源性神经营养因子在孤独症模型鼠颞叶皮层中的表达①

陈淑娟1，姜志梅1，郭岚敏1，张士岭1，孙奇峰1，李丽2，王长山3

目的研究颞叶皮层脑源性神经营养因子(BDNF)表达与孤独症的关系。方法孕12.5 d W istar大鼠腹腔注射丙戊酸钠(VPA)600mg/kg，观察仔鼠(VPA组)的行为学特征，应用免疫组化法检测VPA组与对照仔鼠(对照组，腹腔注射等量生理盐水)颞叶皮层BDNF表达。结果与对照组相比，VPA组表现为低体重(P＜0.05)，睁眼时间延迟(P＜0.05)，协调性反应差(P＜0.05)，方向趋向性反应迟缓(P＜0.05)；社交行为次数减少(P＜0.05)、潜伏期延长(P＜0.05)、持续时间缩短(P＜0.05)，重复行为增多(P＜0.05)。小脑浦肯野细胞数量减少。出生后1 d、7 d、14 d时，VPA组颞叶皮层BDNF表达明显高于对照组(P＜0.01)，而出生后35 d、49 d时，VPA组颞叶皮层BDNF表达明显低于对照组(P＜0.01)。结论颞叶BDNF表达参与孤独症的发病过程。

孤独症；脑源性神经营养因子；丙戊酸钠；大鼠

[本文著录格式]陈淑娟，姜志梅，郭岚敏，等.脑源性神经营养因子在孤独症模型鼠颞叶皮层中的表达[J].中国康复理论与实践,2012,18(5):426-429.

孤独症(autism)又称自闭症，是一种严重的广泛性脑发育障碍性疾病。通常3岁以前发病，至今病因未明。颞叶与社会知觉、语言和“心理理论”能力有关，孤独症患儿存在上述能力缺陷[1]。颞叶与孤独症发病的关系近年来受到广泛关注。本研究观察脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在孤独症动物模型鼠颞叶皮层中的表达情况。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 丙戊酸钠(VPA)：SIGMA公司；兔抗BDNF抗体(l∶1000)、生物素标记山羊抗兔IgG(即用型)、SABC复合物(即用型)、Cy3-山羊抗兔(l∶200)：武汉博士德生物公司。

1.2 模型制备 健康成年清洁级W istar雄性(体重280～300 g)大鼠30只，雌性(体重220～250 g)大鼠60只，购自大连医科大学实验动物中心，饲养于佳木斯大学专用动物房，给予充分饲料和饮水。日光灯维持光照，每天12 h(7:00～19:00)，环境安静，室温25℃左右。实验动物喂养及实验程序均严格遵照佳木斯大学实验动物保护条款执行。

环境适应2周后，于17:00以雌雄比2∶1合笼，次日8:00查阴道涂片，以查得精子为妊娠第1天，孕鼠另笼饲养。

参照Schneider等的方法[2-4]，在孕12.5 d时，模型组孕鼠(n=50)腹腔注射丙戊酸钠600mg/kg(丙戊酸钠粉用生理盐水配成250mg/m l溶液)；对照组(n=10)孕鼠腹腔注射等量生理盐水。模型组母鼠产下的仔鼠记为丙戊酸钠组(VPA组,n=225)，对照组母鼠产下的仔鼠记为生理盐水组(Con组,n=90)；出生当日记为生后第1天(P1)。

1.3 模型鉴定[2-4]

1.3.1 发育学测试

1.3.1.1 体重 取VPA组和Con组P7、P14、P21、P56和P90雄鼠各10只称重。

1.3.1.2 睁眼时间测定 取VPA组及Con组鼠各10只，于P12、P13、P14、P15和P16观察睁眼情况。评分标准：0分：2只眼睛均未睁；1分：1只眼睛睁开；2分：2只眼睛均睁开。

1.3.1.3 方向趋向性检测(倾斜板试验) 取VPA组及Con组鼠各10只，于P7、P8、P9、P10观察方向趋向性情况：将鼠头朝下放在25°光滑倾斜平面上，观察鼠转身180°所用时间。

1.3.1.4 协调性检测(游泳试验) 取VPA组及Con组P9、P11、P13和P15鼠各10只，逐个放于28℃恒温槽中央，观察5～10 s，根据耳与头顶部处于水面位置评分：0分：头顶和鼻在水面以下；1分：鼻在水面以下，头顶在水面以上；2分：鼻和头顶在水面以上或与水面平齐，双耳在水面以下；3分：鼻和头顶位置与2分标准相同，但水位线在耳中间；4分：鼻和头顶位置与2分标准相同，水位线在耳以下。

1.3.2 行为学检测

1.3.2.1 社会交往行为检测 于P35时检测。从两组仔鼠中分别选择被测鼠和搭档鼠各6只，两者之间组别、月龄、性别相同，体重差别≤15 g，分笼饲养。检测在规格为60×60×60 cm旷场箱内进行。实验前2 d，所有鼠被单独放在旷场箱内，每次5m in，每天2次，连续2 d，以减轻对新环境的焦虑。实验前1 h隔离被测鼠。被测鼠和搭档鼠随机配对，共同置于旷场箱中10m in，播放背景音乐。记录社会行为潜伏期(从进入旷场到出现社交行为的时间)、10m in内社会行为次数、每次社会行为持续时间。社交行为包括：一只鼠紧跟同伴保持同步、鼻-鼻嗅探(嗅同伴鼻子和脸)、推挤爬行(与同伴身体接触，包括在同伴身体下推挤，在同伴和墙壁或地板之间推挤，爬过同伴的身体或在其身体之下)和给同伴理毛。非社交行为包括自我理毛和区域探测(绕着某一区域走，嗅探或挖垫草)。

1.3.2.2 重复行为检测 重复行为是指一系列行为以正常模式出现，但持续时间异常[5]。于P21、P35、P49时VPA组和Con组各取10只在干净旷场中进行，每只鼠先适应环境10m in，然后记录10m in内鼠用于整理身体所有部位毛的累积时间。播放背景音乐。由2位观察员用2块秒表同时观看录像记时，取平均值。

1.3.3 形态学检测 取VPA组和Con组P14、P21、P35、P49鼠各5只，制备Nissl染色标本切片。每只取5张小脑切片，应用Olym Pus显微镜及图像分析系统，对小脑浦肯野细胞数量进行分析。每张切片随机选5个视野，取平均值。

1.4 免疫组化检测 取VPA组和Con组P7、P14、P21、P35、P49鼠各5只麻醉，开胸，从心耳部灌洗后迅速断头取脑，置中性甲醛中固定，石蜡包埋，切片厚20μm，每只取6张，5张采用SABC法行颞叶皮层BDNF免疫组织化学染色，1张用PBS代替一抗做阴性对照。应用Olympus显微镜及图像分析系统测定积分光密度(IOD)。每张切片随机选5个视野，取平均值。

1.5 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，所有数据均用(±s)表示，两组均数比较采用t检验。

2 结果

2.1 发育

2.1.1 体重 P7、P14时，VPA组鼠体重与Con组无显著性差异(P＞0.05)；P21、P56、P90时，VPA组体重低于Con组(P＜0.05)。见表1。

表1 各组体重比较(g)

2.1.2 睁眼时间 P12、P13、P14时，VPA组鼠睁眼时间评分较Con组低(P＜0.05)；P15时，两组间无显著性差异(P＞0.05)。P16时及以后，两组鼠均完全睁眼。见表2。

2.1.3 方向趋向性 与Con组比较，各时间点VPA组鼠转身所用时间均长(P＜0.05)。见表3。

2.1.4 协调性反应 与Con组比较，P9、P11、P13时VPA组鼠评分低(P＜0.05)；P15时，两组间无显著性差异(P＞0.05)。见表4。

表2 各组睁眼情况评分比较

表3 各组转身时间比较(s)

表4 各组游泳评分比较

2.2 行为

2.2.1 社会交往行为 与Con组比较，VPA组鼠社交行为次数减少(P＜0.05)，社会行为潜伏期显著增加(P＜0.001)，社交行为持续时间缩短(P＜0.05)。见表5。

表5 不同组社会交往行为比较

2.2.2 重复行为 与Con组相比较，P21、P35、P49时VPA组鼠理毛行为累积时间增多(P＜0.001)。见表6。

表6 各组理毛行为累积时间比较(s)

2.3 形态学 P14、P21时，VPA组鼠小脑浦肯野细胞数与Con组无显著性差异(P＞0.05)；P35、P49时，VPA组鼠小脑浦肯野细胞数减少(P＜0.05)。见表7。

2.4 BDNF表达 P1、P7、P14时，VPA组鼠颞叶皮层IOD值明显高于Con组对应部位IOD值(P＜0.01)；P35、P49时，VPA组IOD值明显低于Con组(P＜ 0.01)。见表8。

表7 各组小脑浦肯野细胞数比较

3 讨论

瑞典研究显示，约30%孤独症儿童母亲在妊娠20～24 d有应用镇静剂史[6-7]。丙戊酸钠可能通过促进胶质细胞凋亡，减少小脑浦肯野细胞，降低内啡肽和增加5-羟色胺等机制导致孤独症[8]。本研究VPA组鼠表现的发育落后、行为异常和形态学异常，支持丙戊酸钠致孤独症鼠模型的有效性。

颞叶皮质功能异常与孤独症发病密切相关。党桂娟等采用单光子发射断层扫描(SPECT)进行脑血流灌注显像，研究显示83%孤独症患者脑血流灌注降低，其中78%的病灶在颞叶、顶枕叶及海马回、扣带回等边缘系统[9]。Goldberg等利用磁共振成像平面回波序列的血氧水平依赖技术(BOLD-fMRI)，显示孤独症患儿左侧颞上回信号增强[10]。Nelson等应用免疫亲和层析法对新生儿时保存的血液样品研究发现，与正常对照组相比，孤独症组新生儿血液样品中BDNF水平较高，认为BDNF高水平表达反映了区域代偿机制或者是孤独症发病过程的一个组成部分[11]。这一结果与本研究出生后1 d、7 d(相当于新生儿)结果一致。

BDNF参与BDNF-Akt-Bcl-2抗凋亡通路。我们推测，BDNF高表达可能是一种保护反应，这种自我保护反应可能与孤独症典型症状在婴幼儿期表现不明显有关。Sheikh等研究发现，孤独症患者大脑中BDNF水平下降，导致调节Bcl-2的Akt激酶表达和磷酸化下降[12]，表明BDNF-Akt-Bcl-2抗凋亡信号通路下调是导致孤独症发病的一个潜在机制。

出生后35 d，与正常组相比，孤独症组BDNF表达降低，BDNF-Akt-Bcl-2抗凋亡通路下调，导致胶质细胞凋亡增加。胶质细胞是神经系统的支架，其凋亡增加使神经纤维难以远程迁移，可解释孤独症的社交互动损害；神经纤维只在局部反复联系，可解释孤独症的重复行为[8]。

BDNF生物作用广泛，是大脑发育和功能的基础。本研究结果表明，颞叶BDNF表达可能参与孤独症的发病过程。对于其具体发病途径，还需要在后续实验中对其信号转导通路进行研究。另外，是否可以通过测定BDNF水平来进行孤独症早期诊断，或者BDNF水平是否可作为继续发展为孤独症的一个标志，还需大量基础及临床试验进行验证。

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第24届全国脊柱脊髓学术会议征文通知

由中国残疾人康复协会脊髓损伤康复专业委员会、国际脊髓学会中国脊髓损伤学会主办，吉林大学中日联谊医院承办的第24届全国脊柱脊髓学术会议将于2012年8月3日～6日在吉林省长春市举行。会议交流形式分为大会发言和展板专题讨论。届时将有欧美、亚太地区、中国大陆及港、澳、台地区的著名专家为大会作学术报告，推出最新基础研究和临床成果及学术动态等。欢迎骨科脊柱外科、康复医学科、神经学科、泌尿外科、中医科、肿瘤科、放射科及相关基础研究领域的同仁踊跃参加并积极投稿。

参会或投稿请登录会议网站（http://www.cscc5413.com）办理投稿、注册和预约参会等事宜。会议注册费：1200元/人；7月3日前网上注册优惠价1000元/人；学生凭学生证注册费600元/人。授予中国医院协会继续医学教育Ⅰ类学分3分。

征文要求：尚未在国家级以上学术会议交流或国内外杂志上公开发表；800字左右文章摘要，w ord文档，宋体，标题四号字，正文五号字。论文应具有先进性、科学性和实用性，论点鲜明、结构严谨、真实可靠；投稿格式：包括中文题目、作者、单位、中文摘要（目的、方法、结果、结论）、关键词，同时应附作者的联系地址、邮编、联系电话及E-mail地址；如大会安排发言需补充英文摘要；投稿方式采用网上注册投稿，并注明是否参会，以便安排发言；截稿日期：2012年7月1日，逾期不予受理，优秀论文可推荐在《中国康复理论与实践》杂志发表。

特别提示：请通过会议网站进行网上注册、投稿及住宿选择，不接受纸质稿件。会议地点：长春国际会展中心大饭店(长春市经济开发区会展大街100号)。联系人：杨玉辉 13804314436；许卓 15043075688；电子邮件（E-mail）：yangyuhuime@163.com。

Exp ression of Brain-derived Neurotrophic Factor in Tem poral Cortex of Autism M odel Rats

CHEN Shu-juan,JIANG Zhi-mei,GUO Lan-min,etal.DepartmentofChild Developmentand Behavior,the Third Affiliated Hospital,Children Neurological Rehabilitation Lab,JiamusiUniversity,Jiamusi154003,Heilongjiang,China

Ob jectiveTo explore the role of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in pathogenesis of autism.M ethods12.5 d pregnantW istar rats were injected sodium valproate(VPA)600 mg/kg or normal saline(NS).Their newborn rats were observed ethologically. The expression of BDNF wasmeasured in their tem poral cortex with immunohistochem ical stain.Resu ltsCompared with NS group,VPA group expressed less body mass(P＜0.05),eyes opening delay(P＜0.05),poorer coordination response(P＜0.05),slower taxis response(P＜0.05).The number of social behavior decreased(P＜0.05),latency increased(P＜0.05),duration shortened(P＜0.05),repetitive activities increased(P＜0.05).Purkinje cells reduced in cerebellum.The expression of BDNF increased significantly in temporal cortex 1 d,7 d and 14 d postnatally(P＜0.01),butdecreased 35 d and 49 d postnatally(P＜0.01).ConclusionBDNF playsa role in the pathogenesisof autism.

autism;brain-derived neurotrophic factor;sodium valproate;rats

R749.94

A

1006-9771(2012)05-0426-04

2012-01-06)

佳木斯大学研究生创新科研项目(YJSCX 2011-018JD)。

1.佳木斯大学儿童神经康复实验室，佳木斯大学第三附属医院，黑龙江佳木斯市154003；2.佳木斯大学第一附属医院儿科，黑龙江佳木斯市154003；3.佳木斯大学基础医学院生物教研室，黑龙江佳木斯市154003。作者简介：陈淑娟(1984-)，女，山东临沂市人，硕士研究生，主要研究方向：脑发育与行为障碍研究。通讯作者：姜志梅。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.05.009