反相高效液相色谱法测定可乐中咖啡因的含量

武开业

（榆林市环境监测总站，陕西 榆林 719000）

0 引 言

咖啡因（C8H10N4O2）是从茶叶、咖啡果中提炼出来的一种甲基黄嘌呤的生物碱，化学名是1，3，7-三甲基黄嘌呤或 3，7-二氢-1，3，7 三甲基-1H-嘌呤-2，6-二酮，纯的咖啡因是白色而具有强烈苦味的粉状物，易溶于水、乙醇、丙酮及氯仿等有机溶剂。

各国制定了咖啡因在饮料中的食品卫生标准，美国、加拿大、阿根廷、日本、菲律宾规定饮料中咖啡因的含量不得超过200μg/mL，南斯拉夫规定不得超过120μg/mL，到目前为止我国仅允许咖啡因加入到可乐型饮料中，其含量不得超过150μg/mL。为了加强食品卫生监督管理，对饮料中咖啡因的含量进行测定是十分必要的。

咖啡因的测定一般采用紫外分光光度法，其优点是响应时间短、灵敏度高、操作简单，缺点是重复性差、回收率低，这可能与光源的稳定性以及试样的前处理步骤比较繁琐有关。

因此，本文采用反相高效液相色谱法（RPLC）测定可乐中咖啡因。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 1525双泵高效液相色谱仪（美国沃特斯公司）；色谱前处理柱；0.45μm滤膜过滤装置（上海摩速有限责任公司）；万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；25μL微量注射器（Australia）；KQ-50B超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；咖啡因标准品（纯度99%以上，广佛精细化工公司）；CH3OH（色谱纯）；三氯甲烷（分析纯）；无水硫酸钠（分析纯）；氯化钠（分析纯）；试剂用水为18.2MΩ二次去离子水。

图1 咖啡因的结构式

1.2 色谱条件

Diomonsil C18（2）5 u 色谱柱（250mm×4.6mm，柱温 30℃）；流动相为甲醇/水（4∶1，流速 1mL·min-1）；紫外检测器。

1.3 样品前处理

由于可乐中含有大量的有机物，这些物质通过色谱柱以后会对柱子造成很大的损害，所以需要对可乐进行前处理。本实验设计了一款树脂填充的色谱前处理柱。样品用超声清洗器在40℃下超声5min，然后经前处理柱过滤，除去绝大部分的有机物，最后经过0.45μm水系滤膜过滤后方可进样。

前处理柱管用一般滴定管改制而成，上层填充吸附树脂（YXA05型40～100目），下层填充阳离子交换树脂（Y2X8型100～150目）。吸附树脂在装前按照以下步骤净化：丙酮浸泡过夜——抽干——甲醇盐酸溶液（1∶1）浸泡4h——过滤——甲醇洗——水洗；阳离子交换树脂在装前经下述步骤净化：甲醇浸泡过夜——过滤——5%HCl浸泡4 h——水洗至无氯离子。装柱时应先装阳离子交换树脂，再装吸附树脂，用去离子水冲洗预处理柱，直至流出液无氯离子为止。分析可乐试样时，取一定量试样，使其流过预处理柱，再用去离子水冲洗，洗水体积应大于床体积5倍以上，收集样液和洗液，定容以后通过0.45μm滤膜进行过滤，然后通过色谱柱进行分析。预处理柱可以连续处理试样，通常用约一个月后用甲醇盐酸溶液（9∶1）洗涤，再用去离子水洗净后又可使用。实验证明本方法可以清除试样中有机物（油溶性）等污染物质，而预处理柱对咖啡因不发生吸附（回收率大于96%）。色谱前处理柱形状如图2所示。

图2 色谱前处理柱

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择优化

本方法的主要目的就是检测可乐中咖啡因的含量，采用美国沃特斯公司的Diomonsil C18（2）5u色谱柱，实验表明该色谱柱对咖啡因有很好的分离性能。

通过选择比较不同的波长条件，发现咖啡因甲醇溶液在286nm波长下有很大的吸收且与其他物质的吸收峰很好地分开，所以选择286nm为测定波长。

通过比较不同的淋洗液体系，发现甲醇/水体系能够很好地分离咖啡因，不会出现峰拖尾、鬼峰以及其他峰不完全分离的情况。经过不同的浓度优化，最终选择甲醇/水（4∶1，流速 1mL·min-1）作为流动相，咖啡因在4min完全出峰。咖啡因色谱图见图3。

图3 咖啡因色谱图

2.2 方法的精密度、线性关系和检出限

配制浓度为 10，20，50，100，150μg/mL 的咖啡因甲醇标准溶液，每个浓度在286nm波长下测定6次峰面积响应值，RSD在0.18%～1.36%之间。分别测定不同浓度的咖啡因标准溶液的吸光度值，咖啡因浓度在10～150μg/mL范围内与峰面积值呈良好线性关系，Y＝1.7×104X-9.99×103，相关系数为 0.9998，方法检出限为为0.72μg/mL。

2.3 实际样品测定

以不同品牌的可乐饮料为实验对象，测定其中含有的咖啡因含量，见表1。

表1 实际样品测定结果及回收率

方法的相对标准偏差RSD在0.38%～1.81%之间，同时做回收率实验，加标回收率为96.8%～101.8%。

3 结束语

可乐类饮料是一种组成复杂的溶液，其中含有的大量色素和其他有机类添加剂，对于可乐成分的分析造成了很大的干扰。通过色谱前处理柱的应用，有效去除了这些干扰组分的影响，实际应用表明，运用液相色谱法可以快速、准确地测定出了可乐饮料中的咖啡因含量，符合食品及无公害饮料标准要求。

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