艾叶多糖的提取、含量测定及对羟自由基清除作用的研究

谭冰严焕宁黄锁义廖慧娴张强

（1右江民族医学院药学系，广西 百色533000；2右江民族医学院临床医学系）

艾叶多糖的提取、含量测定及对羟自由基清除作用的研究

谭冰1严焕宁1黄锁义1廖慧娴2张强2

（1右江民族医学院药学系，广西 百色533000；2右江民族医学院临床医学系）

目的：探讨艾叶多糖的提取、含量测定及其对羟自由基（·OH）的清除作用。方法：采用热水浸提法提取艾叶多糖并进行初步纯化；苯酚-硫酸法测定其含量；·OH清除实验观察艾叶多糖对·OH的作用。结果：样品中多糖含量为2.56%，回收率为98.45%，RSD= 0.391%（n=5），其纯度和产率均较高；艾叶多糖溶液对由Fenton体系产生的·OH有一定的清除作用，随着艾叶多糖浓度的增加，对·OH自由基的清除能力也增强。结论：艾叶中含有一定量的多糖；艾叶多糖对·OH具有较好的清除作用，在一定范围内呈现良好的量效关系。

艾叶多糖；提取；含量测定；羟自由基清除

艾叶（Artemisiae Argyi Folum）为菊科多年生草本植物艾（Artemisia argy lévl.et Vant.）的叶，全国大部分地区均产，具有浓烈香气。其药用历史悠久最早记载于《中医别录》。传统药性理论认为艾叶有理气血、逐寒湿、温经血、安胎、杀虫止痒等作用，用于虚寒出血、尤宜于崩漏[1]。近年药理研究结果发现艾叶有抗菌、抗病毒、平喘、镇咳、祛痰、抗过敏、止血和抗凝血、增强免疫功能、护肝利胆、解热镇静、抑制心脏收缩及降压等作用。艾叶除了含有主要成分挥发油外，还含有鞣质、黄酮、甾醇、多糖、微量元素及其他有机成分等[2]。大量的药理和临床研究表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞，提高机体的免疫功能，而对正常细胞几乎没有毒副作用[3]，近年来对植物多糖的研究已经成为一个热点。本研究对艾叶中活性多糖进行提取、分离纯化以及对羟自由基的清除作用等方面进行考察，旨在为天然药物的开发应用提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 原料与试剂

95%乙醇、无水乙醇、乙醚、盐酸、硫酸、苯酚、氯仿、正丁醇、活性炭、30%双氧水、硫酸亚铁、1，10-菲罗啉、三羟甲基氨基甲烷（Tris）均为分析纯；双蒸馏水；葡萄糖标准品(J＆K CHEMICAL LTD)；艾叶干品（采自广西贵港，粉碎成粉末）。

1.2 主要仪器设备

FW100型高速万能粉碎机 （天津泰斯特仪器有限公司）；电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；DHG-9070A型电热恒温旋风干燥箱（上海精密设备有限公司）；电热式恒温水浴锅（江苏金坛宏凯仪器厂）；循环水真空抽气泵(上海嘉鹏科技有限公司)；RE-52AA型旋转蒸发器 （上海安亭实验仪器有限公司）；78WH-1恒温磁力搅拌器（杭州蓝天化验仪器厂）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；722N型紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）。

2 实验方法

2.1 艾叶多糖的提取

称取粉碎的艾叶粉末10 g，放置烧杯中，加入约150 mL蒸馏水，将其置于电热恒温水浴锅中，温度控制在80℃左右，3 h后，用循环水式多用真空泵进行抽滤，将滤液放入另外的500 mL大烧杯中：用同样的方法重复提取3次，合并3次滤液，用旋转蒸发器浓缩至10～20 mL，冷却至室温后，加入60 mL乙醇，在背光处静置 24 h，抽滤，滤饼依次用乙醇和乙醚洗2次，得到灰色粉末状固体0.812 g。

2.2 艾叶多糖粗品的提纯

2.2.1 活性炭脱色 将多糖粗品置于烧杯中，一定量蒸馏水溶解，加入适量活性炭，于80℃水浴锅中搅拌30 min后过滤，重复脱色2次，得脱色后的多糖粗品溶液。

2.2.2 Sevag法脱蛋白[4]加入相当于前一步骤所得多糖水溶液1/4体积的氯仿，再加入相当于氯仿1/4体积的正丁醇，将混合物剧烈震荡20～30min，然后静置分离，通过分液漏斗除去含有变性蛋白的溶剂层，保留水层，如此重复3次，脱去蛋白质。将脱蛋白质的多糖溶液用恒温磁力搅拌器浓缩成膏状后，用电热恒温旋风干燥箱烘干，即得样品多糖记为w1，称量w1=0.256 0 g。

2.3 艾叶多糖含量测定

2.3.1 标准溶液的测定

2.3.1.1 精密量取5.00 mL苯酚，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，得5.0%的苯酚溶液。

2.3.1.2 精确称量0.010 g葡萄糖，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，得 0.1 mg/mL的葡萄糖溶液。

2.3.2 标准曲线的测定 精确量取葡萄糖对照标准溶液依次为5.00、10.00、20.00、30.00、35.00 mL，置50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，分别稀释成10、20、40、60、70 μg/mL的 5个不同浓度的对照品系列溶液。分别准确量取1.00 mL样品液5份，分别置于10 mL具塞比色管中，加1.50 mL苯酚溶液，再加7.50 mL浓硫酸溶液，混合均匀后放置20 min，用722N型可见光光度计，在486 nm测其吸光度（A），以对照品浓度（C）为横坐标，A为纵坐标做标准曲线，建立回归方程，结果见表1和图1。

表1 紫外可见分光光度计测葡萄糖对照液吸光度

图1 葡萄糖标准曲线

根据以上数据以及作图求得葡萄糖标准曲线回归方程：

相关系数r=0.999 3。

2.3.3 艾叶多糖提取率测定（苯酚-硫酸法[5-6]） 精确称取艾叶粗多糖0.010 g置于10 mL试管中，加入1 mol/L H2SO42 mL，沸水浴水解2 h，冷却至室温，移至 100 mL容量瓶，蒸馏水定容至刻度。按照绘制标准曲线的方法，分别精密量取1.0 mL样品液5份，分别置于10 mL具塞比色管中，加1.5 mL 5.0%苯酚溶液，再加7.5 mL浓硫酸溶液，混合均匀后放置 20 min，用可见分光光度计在486 nm处测其A值，由回归方程计算艾叶中多糖的含量，测定结果如表2。

表2 紫外可见分光光度计平行测定艾叶多糖溶液的A值

根据标准葡萄糖线性回归方程，可以计算出艾叶多糖相当于葡萄糖的浓度，如上表所示。平均浓度C=0.622 μg∕mL。

按下式计算艾叶粗多糖与葡萄糖之间的换算因子F：

式中W为称取粗多糖的质量 (μg)，D为粗多糖稀释倍数(实验中D=1 000)，求得F为16.08。

粗多糖提取率的计算方法[7]如下：

粗多糖提取率(%)=[C×D×F×K／W0×106]×100

式中：C为粗多糖浸提液通过苯酚-硫酸法测定A值再从回归方程求得的粗多糖相当于葡萄糖的含量(μg)；D为稀释倍数(实验中D=1 000)；F为换算因子 （F=16.08）；K为艾叶制备的样品多糖w1与称量的0.010 g艾叶多糖的比值 （K= 25.6）；W0为艾叶干粉质量。

代入数据计算得：粗多糖提取率（%）=2.56%。

2.3.4 回收率的测定 按2.3.2方法，分别量取1、10、20、40、60、70 μg∕mL 5个不同浓度的对照品溶液，置于 10 mL具塞比色管中，加 1.50 mL 5.0%苯酚溶液，再加 7.50 mL浓硫酸溶液，混合均匀后放置20 min，再分别加入2.3.3中的粗多糖溶液0.1 mL，用可见分光光度计在486 nm处测其吸光度值，结果回收率为 98.45%，RSD= 0.391%（n=5）。

2.4 羟基自由基的清除

2.4.1 艾叶样品多糖溶液的配制 精确称取0.246 0 g艾叶样品多糖，放置烧杯中，用少量50℃热水完全溶解后，转移至50 mL容量瓶，用蒸馏水定容，即得浓度为C=4.92 mg/mL的多糖样品溶液。

2.4.2 清除羟自由基的测定 Fenton反应是生物体内存在的·OH体外模式反应。参照Fenton反应的方法建立反应体系模型[8]，利用 H2O2与 Fe2+混合产生·OH（反应式H2O2+Fe2+→Fe3++·OH+OH-）。Fe2+与 1，10-菲罗啉在 pH 2～ 9的范围内可形成稳定的橙红色络合物，在510 nm处有最大吸收。当加入艾叶多糖溶液时，艾叶多糖能清除溶液中游离的·OH，因而可以通过测量A值间接计算出样品艾叶多糖对·OH的清除率。

A0：不加H2O2，而加入样品时的A值。

A1：加入H2O2，但不加样品时的A值。

A2：加入H2O2和样品时的A值。

采用Fenton反应产生羟自由基，在10 mL具塞比色管中依次加入0.2mL1，10-菲罗啉（5mmol/L），1 mL Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol/L，pH 6.0），0.2 mL硫酸亚铁（7.5 mmol/L），0.2 mL H2O2（1%）和不同体积的艾叶溶液，无水乙醇定容到10 mL，然后于37℃超级恒温水浴中反应60 min，在510 nm处测量A值，平行3次。

表3 艾叶多糖清除·OH的清除率

根据表3可绘制艾叶多糖溶液对清除·OH的清除率变化曲线图。

图2 艾叶多糖浓度与清除率的变化关系

从图2中可看出，艾叶多糖溶液对由Fenton体系产生的·OH有一定的清除作用，随着艾叶多糖浓度的增加，对·OH自由基的清除能力也增强。说明艾叶多糖与·OH自由基清除有一定的量效关系，即艾叶多糖浓度增加时，其清除率也增大。

3 结论与展望

3.1 艾叶中含有一定量的多糖，其多糖提取率为2.56%，回收率为98.45%，RSD=0.391%（n=5）。

3.2 艾叶多糖对·OH具有较好的清除作用，且在一定范围内呈现良好的量效关系。多糖具有良好的抗氧化和清除自由基的功能，且不良反应较小。艾叶多糖所具有的抗氧化活性使其有望作为天然抗氧化剂而得到很好的开发应用，本实验对艾叶多糖所进行的含量测定及抗氧化研究，希望能为进一步促进广西艾叶植物资源的开发利用提供科学依据。

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Study on the Extraction of Polysaccharides from Artemisiae Argyi Folum and the Effects on Scavenging of Hydroxyl Radicals

Tan Bing1,Yan Huanning1,Huang Suoyi1，Liao Huixian2,Zhang Qiang2（1 Pharmacy Department of Youjiang Medical University for Nationalities,Guangxi Baise 533000,China；2 Department of Clinical Medicine of Youjiang Medical University for Nationalities）

Objective：To analyze the extraction of polysaccharides from Artemisiae argyi folum，the content determination and the effects on hydroxyl radical scavenging. Methods：To extract Artemisiae argyi folum polysaccharides using hot water extraction and followed by purification.To determine the content using phenol-sulfuric acid method and the effects on scavenging of hydroxyl radicals by hydroxyl radical scavenging test.Results:The content of Artemisiae argyi folum polysaccharides was 2.56%and the recovery rate was 98.45% (RSD=0.391%,n=5).The Artemisiae argyi folum polysaccharides solution showed the effects on scavenging of hydroxyl radicals produced by the Fenton system.With the increasing concentration of Artemisiae argyi folum polysaccharides the scavenging ability of hydroxyl radicals increased.Conclusion：Artemisiae argyi folum contained a certain amount of polysaccharides and the scavenging ability of hydroxyl radicals was proved with good dose-effect relationship within a certain range.

Artemisiae Argyi Folum Polysaccharide；Extraction；Content Determination；Hydroxyl Radical Scavenging

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.03.003

2011-11-15）

谭冰，女，本科在读。研究方向：天然产物有效成分提取及活性研究、中草药有效成分的研究。E-mail：790221072@qq.com

黄锁义，男，教授，硕士生导师。研究方向：天然产物化学、药物化学、食品卫生。通迅作者E-mail：huangsuoyi@163.com