HPLC法测定肾石通颗粒中槲皮素的含量

罗爱勤 陈泽锋

（广州汉方现代中药研究开发有限公司，广东 广州 510240）

HPLC法测定肾石通颗粒中槲皮素的含量

罗爱勤 陈泽锋

（广州汉方现代中药研究开发有限公司，广东 广州 510240）

目的：建立高效液相色谱法测定肾石通颗粒中槲皮素含量的方法。方法：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(200mm×4.6mm)，柱温30℃，流动相为甲醇-水(50∶50)，流速1.0mL/min，检测波长360 nm。结果：槲皮素在0.090 4～0.904 0 μg范围内质量与峰面积积分值呈良好线性关系，平均回收率98.8%，RSD=1.71%。结论：该法灵敏、准确，可作为肾石通颗粒的质量控制方法。

高效液相色谱法；肾石通颗粒；槲皮素；含量测定

肾石通颗粒是由金钱草、王不留行（炒）、萹蓄、瞿麦、海金沙、丹参、鸡内金（烫）、延胡索（醋制）、牛膝、木香等 10味中药制成，具有清热利湿、活血止痛、化石、排石的功效，用于肾结石、肾盂结石、膀胱结石、输尿管结石。收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》（中药成方制剂第二册）。该标准中只有性状、颗粒剂检查项，尚未建立含量测定项。金钱草和萹蓄为方中主药，均含有槲皮素，高效液相色谱法（HPLC）测定槲皮素的含量已有文献[1-5]报道。本研究依照上述文献开展实验，结果证明用磷酸溶液的流动相pH值很小，约为2[6]，供试品溶液含盐酸pH值也约为2，长时间运行后，容易损耗色谱柱和高效液相设备。因此，在已有文献报道HPLC法的基础上，对色谱条件和供试品溶液的制备方法加以改进，建立了HPLC测定肾石通颗粒中槲皮素含量的方法。该法灵敏、快速、准确、重现性好，可有效控制该制剂质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100 Series高效液相色谱仪；依利特十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱 (200 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2 试药

肾石通颗粒及阴性样品 （广州汉方现代中药研究开发有限公司）；槲皮素对照品（原中国药品生物制品检定所，批号为100081-200406），甲醇（色谱纯），水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 色谱条件与系统适应性试验

2.1 色谱条件

依利特十八烷基键合硅胶色谱柱 (200 mm× 4.6 mm，5 μm)，柱温30℃，流动相甲醇-水（50∶50），流速1.0 mL/min，检测波长360 nm。理论板数按槲皮素峰计算不低于2 000。

2.2 系统适用性试验

分别精密吸取槲皮素对照品溶液、供试品溶液、阴性溶液各10 μL注入高效液相色谱仪，测定，色谱图见图1。槲皮素的保留时间约为19 min，与其他组分分离良好（分离度大于1.5）阴性溶液色谱图在槲皮素峰位置无干扰。

图1 高效液相色谱图A对照品 B供试品C缺金钱草、萹蓄阴性溶液

3 对照品溶液的制备

精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇制成每1 mL含槲皮素0.05 mg的溶液，即得。

4 供试品溶液的制备

取本品约20 g，研细，精密称定，加水100 mL，加热回流1.5 h，离心，浓缩至10 mL，加乙醇40 mL，搅拌，静置30 min，滤过，滤液蒸干，用水20 mL使溶解，加盐酸 4 mL，加热回流水解1 h后，放冷，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次24 mL，合并乙酸乙酯提取液，用水洗涤3次，每次70 mL，乙酸乙酯液蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

5 阴性溶液的制备

取缺金钱草、萹蓄的阴性样品，按4项下方法制备，即得。

6 方法学考察

6.1 线性关系考察

分别精密吸取含量为0.045 2 mg/mL槲皮素对照品溶液2、4、6、8、10和20 μL进样。以峰面积A（mAU*s）对槲皮素峰的质量数C（μg）回归，结果见表1和图2。

表1 槲皮素标准曲线的绘制

图2 槲皮素标准曲线

回归方程

相关系数r=0.999 9。

以上结果表明槲皮素在0.090 4～0.904 0 μg范围内，与峰面积积分值呈良好线性关系。

6.2 精密度试验

精密吸取槲皮素对照品溶液10 μL，连续重复进样6次，记录峰面积分别为：543.8587、532.9718、544.747 3、539.142 7、541.521 1、543.615 5，得平均峰面积值为540.976 2，计算RSD=0.82%，表明本测定法精密度良好。

6.3 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在 0、1、2、4、6、8 h进样10 μL测定，以峰面积计算得槲皮素的峰面积RSD分别为0.63%（n=6），表明供试品溶液中槲皮素在 8 h内稳定[7-9]。

6.4 重复性试验

取同批供试品（110701-1）6份，研细，精密称定，按4项下方法制备，进样10 μL测定，测得槲皮素0.006 mg/g，RSD为2.25%（n=6），表明本法具有良好的重复性。

6.5 准确度试验

采用加样回收法，取已知含量样品(110701-1)，研细，精密称取6份，每份10 g，分别置6只具塞锥形瓶中，精密加入含槲皮素对照品0.06 mg/mL的对照品溶液 1 mL，按 4项下方法制备，进样10 μL测定，测得槲皮素回收率98.80%，RSD= 1.71%（n=60）。

7 样品测定

取3批样品 (110701-1、110821、110822)及另外5个厂家市售的肾石通含糖颗粒，按4项下方法制备，分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪，测定样品中槲皮素的含量，结果见表2。

表2 肾石通颗粒槲皮素含量

8 讨论

本测定法中的流动相，用水替代了磷酸溶液，结果表明加磷酸对槲皮素的峰形和保留时间影响不大，因此，本研究把流动相设为甲醇-水[10]混合溶液。另外还比较了不设柱温和柱温设为30℃[11]槲皮素峰的保留时间，发现柱温设为30℃时，槲皮素在12 h内保留时间稳定，而不设柱温，槲皮素保留时间不稳定。

槲皮素在冷水中几乎不溶，由于显弱酸性，在冷的酸水中的溶解度很小。槲皮素能溶于乙酸乙酯和正丁醇等与水不相溶的溶剂，因此，在研究供试品溶液制备方法过程中，用乙酸乙酯提取槲皮素，用水饱和正丁醇提取剩余溶液以检验乙酸乙酯的提取是否完全。结果显示用乙酸乙酯提取3次后，乙酸乙酯层溶液接近无色，接着用水饱和正丁醇提取不出槲皮素，说明乙酸乙酯已经提取完全。用蒸馏水洗涤乙酸乙酯溶液，洗涤至3次即能达到中性，且槲皮素无损失。

此外，本研究还对供试品溶液的提取方法(加热回流、超声、微波提取[12]等)，提取溶剂(水、甲醇、65%乙醇、乙醇等)，溶剂的量，提取时间，水解前加水量，加酸量和水解时间等进行了考察，从而得出供试品溶液制备方法，该法其他成分干扰少，分离度令人满意。

本研究建立的HPLC测定槲皮素含量的方法稳定性、重复性好，精密度、回收率都较满意，能有效控制肾石通颗粒的质量。

[1] 吴戌，秦英，石宁.高效液相色谱法测定肾石通颗粒中槲皮素的含量[J].中国新医药，2003，2（10）:30-32.

[2] 何勇.高效液相色谱法测定肾石通颗粒中槲皮素的含量[J].安徽医药，2006，10（2）:119-120.

[3] 肖峰，张敏.HPLC法测定肾石通颗粒中槲皮素含量[J].安徽医药，2009，13（1）:34-36.

[4] 王义恩.高效液相色谱法测定肾石通颗粒中槲皮素与山柰素含量[J].中国药业，2010，19（7）:27-28.

[5] 雷爱海，杜洪涛，李艳林，等.肾石通颗粒质量控制方法研究[J].大理学院学报，2010，9（8）:6-9.

[6] 文才华，涂文升.HPLC法测定肾石通颗粒中延胡索乙素含量[J].中国医药指南，2010，8（34）:230-231.

[7] 董翠萍.HPLC法测定肾石通颗粒中原儿茶醛的含量[J].齐鲁药事，2011，30（9）:505-506.

[8] 巴小翠，李强.肾石通颗粒中丹酚酸B含量测定研究[J].中国科技信息，2011（14）:169，175.

[9] 张俊燕.肾石通颗粒中丹酚酸B的含量测定方法研究[J].齐鲁药事，2011，30（6）:329-330.

[10] 赵焕君，赵琳，孙长晶，等.高效液相色谱法测定槲树叶中槲皮素的含量[J].化学工程师，2011，25（7）:23-24.

[11] 王晓娟，侯安国，王芳菲.彝药明目茶中槲皮素含量测定方法研究[J].云南中医中药杂志，2011，32（9）:66-67.

[12] 张双灵，姜豪，于春娣.微波辅助提取荷叶中槲皮素的工艺研究[J].农机化研究，2011，33（9）:173-175，180.

Content Determination of Quercetin in Shenshitong Granules by HPLC

Luo Aiqin，Chen Zefeng(Guangzhou Hanfang Pharmaceutical Co，Ltd.，Guangdong Guangzhou 510240，China)

Objective:To develop a method for the content determination of quercetin in Shenshitong Granules by HPLC.Methods:Chromatographic column(200 mm×4.6 mm)of octadecylsilane chemically bonded silica was used.The column temperature was at 30℃，the mobile phase was methanol-water(50∶50)，the flow rate was 1.0 mL/min，and the detection wavelength was at 360 nm. Results:There was a good linear relationship between the quality and peak area integral value in the range of 0.090 4～0.904 0 μg for quercetin.The average recovery rate was 98.8% (RSD=1.71%).Conclusion:The method is sensitive，accurate and can be used for quality control of Shenshitong Granules.

HPLC；Shenshitong Granules；Quercetin；Content Determination

10.3969/j.issn.1672-5433.2012.03.005

2011-11-08）

广东省科技计划项目——以动态逆流提取和纳滤浓缩为核心的高效节能成套技术及装备的开发（2009A030901008）

罗爱勤，女，制药工程师，执业药师。研究方向：中药新药和保健食品。E-mail：aiqin1114@163.com