大白菜GIF蛋白家族的生物信息学分析

王凤德 李利斌 李化银 刘立峰 高建伟

摘要：GIF(GRF-interactingfactor)家族是一类含有sNH和QG结构域的蛋白质，可与GRF(Growth reg-ulating factor)转录因子蛋白相结合形成功能复合体，通过促进和维持细胞的分裂能力参与调控植物叶器官的发育。本研究系统鉴定了5个大白菜的GIF基因，并对这些基因编码的蛋白质序列进行了保守性和系统进化分析，最后对BrGIF1基因的表达进行了分析。结果表明，所有的大白菜和拟南芥GIF蛋白家族成员都具有高度保守的sNH和QG结构域。在进化上，G1F蛋白家族可分为两个不同的亚家族，并且这种特征在大白菜和拟南芥分离之前就已经形成。在表达模式上，BrGIF1基因在具有较大叶球的菜自交系及具有较强细胞分裂能力的组织中的转录表达水平较高。另外，BrGIF1基因的表达受到NAA的诱导和ABA的抑制。这些结果表明大白菜GIF蛋白可能具有和拟南芥GIF蛋白相似的生物学功能，在调控植物器官发育中具有重要作用。

关键词：大白菜；GIF蛋白；基因家族；表达模式

中图分类号：Q781文献标识号：A文章编号：100－4942(2012)01－0001－06

大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)起源于中国，是我国乃至世界性的重要蔬菜作物之一。叶球是大白菜食用的最主要器官，其大小是目前开展大白菜育种工作所要考虑的一个重要经济性状。多年的生产实践表明，大白菜叶球的大小受严格的遗传控制，受相关基因表达调控的影响。开展大白菜叶球大小相关基因的研究对于从遗传上控制叶球的大小，提高其产量和品质有重要的理论意义和实用价值。

GIF(GRF—interacting factor)蛋白是植物体内一类转录共激活因子，在功能上与人类SYT转录共激活因子同源，同属于SSXT超家族基因。在蛋白结构上，GIF和SYT蛋白都具有明显的N-末端SNH结构域，但在C-末端二者稍有差别，SYT蛋白在C-末端QPGY结构域富含Gln、Pro、Gly和Tyr氨基酸残基，而GIF仅富含Gln和Gly氨基酸残基，因此GIF蛋白的C-末端被称为QG结构域。已有的研究表明，拟南芥中GIF蛋白家族由3个成员组成，即AtGIF1、AtGIF2、At-GIF3。在这3个成员中，AtGIF1是发现最早也是研究的比较多的一个基因，其N-末端区的SNH结构域可与GRF(Growth regulating factor)转录因子结合形成功能复合体，通过促进和维持细胞的分裂能力达到调控植物器官大小的目的。例如，AtGIF1基因功能缺失突变体由于叶细胞数目减少而使得叶片变小、变窄，而过量表达AtGIF1基因的拟南芥植株由于叶细胞数目增多则表现出叶器官增大的表型。此外，近年的研究发现，AtGIF2和AtGIF3基因具有与AtGIF1基因类似的生物学功能，在调控植物细胞分裂能力中也具有重要的作用。

虽然GIF基因的功能在拟南芥中已经有所研究，但GIF蛋白在不同物种间是否具有类似的调控功能尚不得而知。在本研究中，笔者对同属十字花科的大白菜GIF蛋白家族成员进行了相关的生物信息学分析，并对BrGIF1基因在大白菜中的表达模式进行了研究，以期为揭示GIF蛋白在不同物种间的生物学功能提供依据，同时也为下一步利用基因工程手段提高大白菜产量奠定基础。

1材料与方法

1.1材料培养与处理

供试大白菜自交系：Brap-197、Brap-210、Brap-251、Brap-254、Brap-271、 Brap-272、Brap-262、Brap-310、Brap-317、Brap-340为本实验室自有，挑选籽粒饱满的种子按济南地区正常播种期播种在山东省农业科学院蔬菜研究所试验田内。

大白菜包叶组织收集及叶球大小统计：待大白菜结球期刚刚开始(心叶开始卷曲)时切取卷曲的心叶(包叶)；待大白菜叶球停止生长(休眠期)时对叶球鲜重和最外层球叶大小进行统计。

大白菜不同组织材料收集：待大白菜(Brap-197)长到23～25叶(心叶开始卷曲)时，分别切取包叶、完全展开的莲座叶、根尖以及短缩茎。

NAA和ABA处理材料收集：将种子(Brap-197)消毒后，28℃、光照16h/黑暗8h周期下，培养皿(垫两层滤纸)中培养8天，然后用5μmol/LNAA、50μmol/L ABA或者蒸馏水(DW)对大白菜幼苗进行喷雾处理，以叶片上附着细密水珠但不流淌为宜，分别于处理后0、1、3、6、9、12h收集处理叶。

1.2大白菜GIF家族成员搜索

利用已报道的拟南芥GIF蛋白家族成员基因(表1)，通过Blastn程序在NCBI数据库(http：//WWW.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索相似的基因序列，然后利用DNAMAN软件预测其编码氨基酸序列。将预测的编码氨基酸序列通过Blastp程序在NCBI数据库进行检测，若属于SSXT超家族，则认为其属于大白菜GIF蛋白家族成员。

1.3序列比对和系统进化树分析

利用DNAMAN软件，对大白菜GIF蛋白家族的氨基酸序列进行多序列比对分析，采用默认参数设置。使用MEGA4.0对大白菜和拟南芥中GIF蛋白家族成员做系统进化分析，采用Boot-strap Test-Neighbor Joining方法，重复1000次运算。

1.4表达模式分析

RNA提取和反转录分别采用Trizol总RNA提取试剂盒(Invitrogen，美国)和cDNA第一链合成试剂盒(Takara，日本)，步骤按试剂盒说明书进行。荧光实时定量PCR(RT-qPCR)使用IQ5实时定量PCR系统(BIO-RAD，美国)和SYBRGreen Master Mix试剂(Takara，日本)。RT- qPCR引物采用Primer Express 2.0软件(AppliedBiosytems，美国)设计，BrGIF1引物为：BrGIF1-F：5'-ATGCAACAGCACCTGATGCAGATG-3'和BrGIF1-R：5'-TCAGTTCCCATCATCTGAT-GACTT-3'。RT-qPCR反应体系为20μl，引物终浓度为0.25μmol/L，模板为2μl稀释10倍后的cDNA。反应采用两步法进行：95℃ 1.5min；然后95℃15s，60℃30s，40个循环，并在全部循环结束后制作融解曲线，检测是否有引物二聚体生成。大白菜Actin基因(引物为Actin-F：5'-GCTTACGTCGCTCTTGACTACG-3'和actin-R：5'-GATGGTGATGACTTGTCCATCAG-3')作为内参，以cDNA0倍浓度梯度稀释溶液作为模板制作标准曲线，利用标准曲线法计算基因的相对表达量。每个反应3次重复。并且以未反转录

RNA样品作为对照，防止DNA污染。

2.结果与分析

2.1大白菜和拟南芥GIF家族蛋白的保守序列分析和系统进化分析

通过各种Blast搜索和比对，从现有的大白菜基因组数据中鉴定出5个GIF蛋白家族基因(表1)，分别命名为BrGIF1～BrGIF5(其中BrGIF1～BrGIF4为EST序列，BrGIF5为基因组序列)，这些结果说明大白菜基因组中至少存在5个GIF蛋白家族基因。比拟南芥具有更多GIF基因的原因可能与大白菜基因组比拟南芥的复杂有关。为了确定植物中GIF蛋白的序列特征，用DNAMAN软件对5个大白菜的和3个拟南芥的GIF蛋白家族的氨基酸全序列进行多序列比对分析，结果表明供试序列之间存在较高的同源性，都具有两个相对保守的结构域，即位于N-末端的SNH结构域和位于C-末端的富含Gln和G]y的QG结构域(图1)，这说明供试蛋白之间在生物学功能上可能具有相似性。

根据系统进化树(图2)分析，可将大白菜和拟南芥中的GIF蛋白分成I和Ⅱ两个亚家族，每个亚家族都包含几个大白菜和拟南芥的GIF基因，表明这一基因家族的基本特征在大白菜和拟南芥分离之前就已经形成，但是GIF蛋白在这两组中的进化关系各不相同，如在I组中的BrGlF1和BrGIF4和Ⅱ组中的BrGIF2和BrGIF3表现为旁系同源关系。在I组中的AtGIF1和BrGIFl、BrGIF4、BrGIF5之间，以及Ⅱ组中的AtGIF2与

BrGIF2、BrGIF3之间可以归类为直系同源进化基因，它们在大白菜和拟南芥中可能具有相似的功能。

2.2大白菜BrGIFl基因表达模式分析

为了全面探索大白菜GIF蛋白在调控植物器官大小中的作用，采用RT-qPCR方法，以大白菜肌动蛋白基因Actin为基因表达内部参照，对大白菜BrGIF1基因在结球初期不同品种大白菜包叶中的表达，结球初期大白菜根、茎、莲座叶和包叶中的表达以及受NAA和ABA处理后的表达模式进行了分析。结果(图3、图4、图5)表明，在结球初期的包叶中，叶球较大的品种具有较高的Br-GIF1转录水平，例如Brap-197与Brap-251相比，前者叶球的重量约是后者的10.4倍；而Br-GIF1在结球初期包叶中的表达量前者约是后者的34.6倍，这表明BrGIF1的转录表达水平与大白菜的叶球大小之间具有密切的相关性。

对BrGIF1在结球初期不同组织中的转录表达水平进行检测，发现BrGIF1在包叶中表达量最高，其次为根尖，再次为莲座叶，茎中的表达量最低(图6)。

在培养8天的大白菜幼苗中，NAA和ABA处理对BrGIF1的转录表达影响存在显著差异(图7)。NAA处理后1h BrGIF1的转录表达水平达到一个相对较高的水平，6h时与DW处理的表达水平类似，6h后BrGIF1的表达量在检测时限内一直处于上升趋势。而ABA处理后Br-GIF1的转录表达受到抑制，在6h时达到最低水平，然后表达水平开始恢复，并在12h时达到与DW处理类似的水平。在整个处理期间，DW对BrGIF1的表达无明显影响。这说明NAA处理能诱导BrGIF1的表达，而ABA处理则抑制BrGIF1的表达。

3.结论与讨论

本研究利用比较基因组学的方法，以拟南芥GIF蛋白家族基因为搜索对象，从大白菜基因组数据库中筛选到5个GIF蛋白家族基因。通过对拟南芥和大白菜GIF蛋白家族基因的序列保守性和系统进化分析发现，大白菜和拟南芥GIF蛋白家族之间存在较高的保守性，尤其在SNH和QG结构域的保守性更为明显，这种序列上的保守性提示大白菜GIF蛋白和拟南芥GIF蛋白之间可能具有功能上的相似性。

在拟南芥中GIF蛋白调控植物器官大小的机制在于促进和/或者维持细胞分裂能力，因此，在具有较强细胞分裂能力的组织或器官中应该具有较强的转录活性，例如在拟南芥茎尖和根尖组织可检测到AtGIF1具有较高的转录表达水平，而在最上部的茎和成熟叶中的表达量则相对较低。

为了进一步探索大白菜GIF蛋白家族在调控植物器官大小中的作用，本研究以BrGIF1为代表，利用RT-qPCR的方法研究了其在大白菜中的表达模式。结果表明，BrGIF1在结球初期包叶中的表达水平与大白菜叶球大小之间存在密切的相关性，即较大叶球具有较高的BrGIF1转录水平。

BrGIF1在大白菜结球初期的包叶和根中具有较高的mRNA水平，在莲座叶和茎中则表达量较低，这可能与此时的包叶正处于生长旺盛期，细胞分裂能力较强，而莲座叶和茎已基本停止生长，细胞分裂能力较弱有关。

生长素是植物体内的一种重要内源激素，在调控植物细胞分裂和生长中具有重要作用，并已被广泛应用于植物细胞培养的植株再生。在研究中发现，生长素抗性的拟南芥突变体由于细胞数目的减少而使得器官变小。此外，参与调控植物细胞分裂的CycD3；1、COKA；1和BrAR-GOS基因的转录表达也受到生长素的调控。与生长素的作用相反，ABA则具有抑制多种植物细胞有丝分裂的能力。在本研究中，笔者分析了BrGIF1对外源NAA和ABA处理的响应，发现BrGIF1的转录表达可被NAA诱导，被ABA抑制。

本试验较系统地研究了大白菜GIF蛋白家族成员的结构特点、系统进化关系，并对其中的一个成员BrGIF1基因的表达模式进行了分析，这对进一步研究GIF蛋白家族在植物发育过程中的调控作用具有重要意义，也为进一步利用基因工程手段改良大白菜品质奠定了基础。