生姜茎基腐病病原拮抗细菌的筛选与鉴定

韩超　武贵元　刘爱新　徐坤

摘 要： 从生姜根际土壤分离得到62个细菌分离物。以姜茎基腐病病原菌（Pythium myriotylum）为指示菌，共选出7株对姜茎基腐病菌有良好拮抗效果的细菌菌株。经过形态学观察、生理生化测定，16S rDNA序列及系统发育分析，结合《常见细菌系统鉴定手册》等，X-11、JK-14、SF-19、SF-23等4株初步鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus spp），JK-19、JK-28、JK-25 3株鉴定为类芽孢杆菌属（Peanibacillus spp）。SF-19、SF-23、JK-25、JK-19、JK-28、X-11和JK-14的16S rDNA序列的GenBank登录号分别为JQ283970、JQ283971、JQ283972、JQ283973、JQ283974、JQ283975、JQ283976和JQ283977。进一步分析表明，7株拮抗菌对Rhizoctonia solani、Fusarium graminearum、Verticillium dahliae等多种类型的病原真菌有较好的抑制作用；显微观察结果表明，拮抗菌可导致病菌菌丝细胞顶端膨大、菌丝体畸形、分隔增多等变化。

关键词：生姜茎基腐病；Pythium myriotylum；根际；拮抗细菌；鉴定

中图分类号：S476+.1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）11-0084-06

Screening and Identification of Antagonistic Bacteria against

Ginger Rhizome Rot Pathogen Pythium myriotylum

Han Chao1， Wu GuiYuan1， Liu AiXin1*， Xu Kun2*

（1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018，China；

2. College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University， Taian 271018，China）

Abstract Sixty-two bacteria were isolated from the ginger rhizosphere soil and seven showed better antagonistic effects to Pythium myriotylum. According to the results of morphologic characteristics， physiological and biochemical properties and phylogenetic analysis of bacteria 16S rDNA， the strains of X-11， JK-14， SF-19 and SF-23 were preliminary identified as Bacillus spp.， and the strains of JK-19， JK-28 and JK-25 belonged to Peanibacillus spp.. The sequences of 16S rDNA of the 7 strains had been submitted to GenBank， and their accession numbers were as follows：SF-19 as JQ283971， SF-23 as JQ283972， JK-25 as JQ283973， JK-19 as JQ283974， JK-28 as JQ283975， X-11 as JQ283976， JK-14 as JQ283977， respectively. All the 7 strains also showed inhibition to Rhizoctonia solani， Fusarium graminearum， Verticillium dahliae and so on. The microscopic examination showed that the antagonistic bacteria could make the hypae cell tip swollen， the mycelia deformed and the compartment increased.

Key words Ginger rhizome rot； Pythium myriotylum； Rhizosphere； Antagonistic bacteria； Identification

生姜茎基腐病又称生姜软腐病、生姜茎腐病等，是目前生姜生产中危害最严重的病害。该病最早报道于印度，现已遍布日本、韩国、斐济、澳大利亚、中国及台湾等多个国家和地区[1，2]。姜茎基腐病主要危害植株茎基部及姜块，表现为地上部植株枯黄，地下茎及姜块腐烂，一般地块可损失8%～30%，重病地块可减产50%～90%，甚至绝产[2]。有研究表明，引起生姜茎基腐病的病原为群结腐霉（Pythium myriotylum）。该病菌主要通过病田土壤传播，同时带菌姜块在储存及移栽时也可进一步加重该病的发生和危害。目前国内外对该病害多采用化学农药进行防治[3，4]，由于该病原菌主要存在于土壤，因此药剂防治不但会出现因用药量大而带来的环境污染问题，而且很难从根本上治理该病害。利用根际有益微生物防治该类病害具有独特的优势，并在土传病害防治研究中开展了很多有益尝试[5，6]。本研究从发生姜茎基腐病的土壤中分离、鉴定到7株对茎基腐病菌有良好拮抗效果的细菌，并对其抑菌效果和抑菌机理进行了初步分析，为进一步开展生姜茎基腐病的生物防治提供了依据。

1 材料与方法

11 试验材料

于2011年8～9月份生姜茎基腐病发病盛期，从山东泰安、莱芜等生姜种植区的发病地块采集土壤样品，用于拮抗细菌的分离。

以生姜茎基腐病菌（Pythium myriotylum）为指示菌筛选拮抗菌，立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、甜瓜黑斑病菌（Alternaria alternata）、棉花黄萎病菌（Verticillium dahliae）、烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica）和黄瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）等用于抑菌谱测定，所用供试真菌均由本实验室保存。

12 培养基

拮抗细菌分离、纯化和培养用NA培养基，病原真菌培养及拮抗菌筛选用PDA培养基，具体配制参照《微生物学实验技术》[7]。

13 生姜根际细菌的分离与筛选

131 拮抗菌分离 称取6 g土样放入50 ml三角瓶中，加入30 ml无菌水，振荡40 min，使之充分混匀。取1 ml上述悬浮液，加入10 ml离心管中，再加入9 ml无菌水，制备成10-1的悬浮液，同样方法制备10-2、10-3浓度的悬浮液。用移液枪吸取50 μl稀释倍数为10-3的溶液，加入NA固体培养基平板上，均匀涂布，放入28℃恒温培养箱培养48 h。将培养后长出的单个菌落分别用灭菌牙签转接到NA固体培养基平板，将纯化的细菌28℃培养24 h后，存于30%甘油中，-80℃下保存备用。

132 拮抗细菌的筛选 取处于对数生长期（OD600=05）的纯化好的细菌分离物15 μl， 滴于PDA培养基平板的中心位置，于28℃恒温培养2 d后，将指示菌Pythium myriotylum接种于PDA培养基上，距病原菌菌落约3 cm，28℃继续培养2 d，检测抑菌效果。根据抑菌圈大小、指示菌及待测分离物菌落扩展速度、菌落边缘是否出现稀疏和萎缩现象等判断拮抗作用。对抑菌圈半径大于15 cm的菌株，认为对指示菌的生长与繁殖具有明显抑制作用[8]。试验重复3次，将具有稳定拮抗效果的分离物保存于30%甘油中，-80℃冰箱保存备用。

14 拮抗菌株的抑菌活性测定

对筛选出的拮抗菌进行抑菌活性测定，以R solani、F graminearum、A alternata、V dahliae、P parasitica、C orbiculare等6种真菌作为供试菌，采用132所述方法进行抑菌活性测定，每处理重复3次。

15 拮抗菌鉴定

151 形态观察与生理生化鉴定 对拮抗效果较好的细菌在NA培养基上28℃恒温培养，待长出菌落后，对其菌落特征进行观察并记录[9]。

对菌体生理生化指标进行测定[10，11]，包括过氧化氢酶（接触酶） 、明胶液化、淀粉水解、V-P试验及产H2S试验等。

152 DNA提取和16S rDNA基因扩增及序列分析 菌株在LB培养基28℃下振荡培养至对数生长期，7 200 r/min离心，收集菌体。提取细菌基因组DNA[12，13]，用细菌16S rDNA通用引物（27F： AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R： GGTTACCTTGTTACGACTT）进行PCR扩增[14]。

PCR反应体系（ 25 μl）为Taq酶（ 5 U/μl） 05 μl，10×Buffer（Mg2+） 25 μl，dNTPs（各25 mmol/L） 2 μl，引物各1 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O 172 μl。PCR反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收试剂盒回收目的片段，送上海桑尼生物科技有限公司测序。

将所测16S rDNA序列用BLAST软件与GenBank数据库进行相似性比对，采用DNAMAN v522程序进行多序列同源性分析。使用MEGA50软件构建phylogeny中的Construct/Test Neighbor-Joining Tree，进化距离采用Jukes-Cantor Model计算，系统树各分枝的置信度经重抽样法（Bootstrap）1 000次重复检测[15]。

所有数据统计分析采用SPSS 130（包括ANOVA方差分析）完成。

16 抑菌机制初步分析

参照132的方法对抑菌作用较好的菌株JK-14的抑菌机制进行分析，用牙签挑取对峙培养2 d的姜茎基腐病菌和立枯丝核菌的菌落边缘，取少许菌丝制片，显微镜下观察待测真菌菌丝形态的变化。2 结果与分析

21 拮抗细菌的筛选及拮抗效果

利用平板稀释法从土壤样品中分离到62个细菌分离物，以姜茎基腐病菌为指示菌，筛选出7个具有良好拮抗作用的菌株，分别是X-11、JK-14、SF-19、SF-23、JK-19、JK-28、JK-25， 7个菌株中以JK-14对P myriotylum抑菌作用最好，抑菌半径为219 mm（表1）。部分菌株对P myriotylum的抑菌效果如图1。

JK-14 JK-19 JK-28

图1 部分细菌菌株对姜茎基腐病菌的抑菌效果

22 拮抗菌菌株对7种病原真菌的抑制作用

对7株拮抗作用明显的细菌与其它真菌进行对峙培养，测定抑菌效果。结果表明，7株拮抗菌对R solani、V dahliae、A alternata等6种植物病原真菌也表现较好的抑菌活性（表1）。由表1可见，JK-14对P myriotylum、V dahliae和A alternata都表现较好的抑菌作用，与其它菌株相比差异明显。 JK-19对R solani抑菌效果最好，抑菌半径约25 mm，X-11对F graminearum、V dahliae和P parasitica等3种真菌的抑菌作用都明显好于其它菌株。

表1

7株细菌对7种病原真菌的抑菌作用

拮抗菌 抑菌圈半径（mm）

姜茎基腐病菌

Pmyriotylum 立枯丝核菌

R solani 小麦赤霉病菌

F graminearum 甜瓜黑斑病菌

A alternata 茄子黄萎病菌

V dahliae 烟草黑茎病菌

P parasitica 黄瓜炭疽病菌

C orbiculare

JK-19 213±06b 251±07a 199±04c 234±08bc 235±07b 188±04f 214±07b

SF-23 207±08c 167±05c 74±09e 229±05c 226±05cd 195±09e 68±04d

JK-14 219±04a 229±08bc 194±10d 241±14a 240±14a 222±06b 201±05c

JK-28 202±05cd 237±15b 202±02b 206±05e 207±05d 210±15c 229±05a

SF-19 183±10e 131±06d 64±03f 225±06d 224±08cd 207±11d 66±02de

X-11 189±05d 113±13e 207±11a 238±03b 238±05a 230±10a 62±06e

JK-25 212±02b 229±08bc 203±02b 227±04d 229±04c 211±13c 216±08b

注：表内同列不同小写字母表示差异显著（P<005）。

23 拮抗菌株的形态和生理生化鉴定及16S rDNA基因序列分析

革兰氏染色结果表明，7株拮抗菌均为革兰氏阳性菌，在NA培养基上的单菌落形态描述见表2。

表2

7株拮抗细菌的菌落形态特征

菌株编号 颜色 透明度 粘稠度 菌落大小 形状 表面光滑度 边缘整齐度

X-11 黄色 不透明 不粘稠 较小 圆形 粗糙 不整齐

JK-14 乳白色 不透明 粘稠 大 圆形 光滑 整齐

SF-19 乳白色 不透明 不粘稠 大 圆形 粗糙 整齐

SF-23 黄色 不透明 不粘稠 较大 圆形 粗糙 整齐

JK-19 浅黄色 不透明 不粘稠 较大 圆形 粗糙 整齐

JK-28 浅黄色 不透明 不粘稠 较大 圆形 粗糙 整齐

JK-25 浅黄色 不透明 不粘稠 较大 圆形 粗糙 整齐

根据菌株的生理生化鉴定结果（表2），对照《伯杰氏细菌鉴定手册》[11]和《常见细菌系统鉴定手册》[10]进行检索，初步认定X-11、JK-14、SF-19、SF-23等4株菌为芽孢杆菌属（Bacillus） ；JK-19、JK-28、JK-25等3株菌为类芽孢杆菌属（Peanibacillus）。

对上述菌株进一步用细菌16S rDNA进行测定， 7个菌株中都扩增出一条约1 400 bp左右的片段。对扩增片段进行序列测定，并在NCBI数据库中与已报道的细菌16S rDNA进行BLAST比较，并用MEGA50软件分析系统进化关系（图2），结果显示，菌株X-11、JK-14、SF-19、SF-23与Bacillus spp位于同一分支；菌株JK-19、JK-28、JK-25与Peanibacillus spp位于同一分支。

图2 基于16S rDNA的系统进化树

结合形态学观察和生理生化测定结果（表3），最终鉴定X-11为Bacillus altitudinis，JK-14、SF-19和SF-23为Bacillus pumilus；JK-19、JK-28和JK-25为Peanibacillus polymyxa。SF-19、SF-23、JK-25、JK-19、JK-28、X-11和JK-14的16S rDNA序列的GenBank登录号分别为JQ283970、JQ283971、JQ283972、JQ283973、JQ283974、JQ283975、JQ283976和JQ283977。

24 拮抗细菌JK-14对病菌的作用机制

以姜茎基腐病菌（P myriotylum）和立枯丝核菌（R solani）为指示菌，对抑菌作用最好的菌株JK-14的抑菌机制进行了初步分析，结果如图3。从图3可以看出，JK-14与P myriotylum对峙培养2 d后，菌丝生长受到明显影响，菌体畸形，顶端膨胀呈囊泡状（图3a，白色箭头）。部分菌丝体细胞向内凹陷溢缩，形成横隔膜，并最终与菌丝体其它部位脱离（图3a、b黑色箭头）；而对照细胞生长正常，菌丝体表面平滑，均匀，无溢缩或隔膜产生（图3c）。图3d、e是R solani的菌丝体的变化，可见菌丝体也表现末端膨大、姜瓣状过度分支、分支畸形等特点（图3d、e白色箭头）。此外，R solani还表现菌丝体细胞变短、分隔增多等，有些细胞内有明显的红褐色沉积物（图3d、e黑色箭头），而对照中菌丝体细胞无此现象（图3f）。

表3 7株细菌与模式菌株的的生理生化特征比较

特征 Bacillus

subtilis X-11 JK-14 SF-19 SF-23 Peanibacillus

elgii JK-19 JK-28 JK-25

葡萄糖 + + + + + + + + +

阿拉伯糖 + + + + + + + + +

木糖 + + + + + + + +

甘露糖 + + + + + + + +

氧化酶 + + - + + + + +

接触酶 + + + + + + + +

硝酸盐还原 + + + + + + + + +

甲基红 + - + + + + + +

V-P试验 + + + + + - - - -

H2S产生 + + + + - - - -

吲哚产生 - - - - - - - - -

淀粉水解 + - + - - + + + +

明胶液化 + + + + + + + + -

七叶苷水解 - - - - - - - -

苯丙氨酸脱氨 - - - - - - - - -

50℃ - - - - - - - -

5%NaCl

（w/v） + + - + + - - - -

10%NaCl

（w/v） + - w w - - -

15%NaCl

（w/v） - - - - - - -

pH56 + w + + - - - -

注：+ ，阳性； - ，阴性； w，微弱阳性。 3 讨论

Bacillus spp和 Peanibacillus spp存在于多种植物的根际，是植物根际土壤中较为普遍的微生物类群，其中的很多种类可通过分泌抗菌物质、促进植物生长、诱导植物的系统抗病性等机制实现抗病促生作用。目前芽孢杆菌在多种植物镰刀菌（Fusarium sp）枯萎病、Rhizoctonia sp引起的根茎病害、Sclerotinia sclerotiorum茎腐病等土传病害的防治方面有很多研究和应用[16～20]，其中，Bacillus subtilis中的有些菌株已在美国被登记用于草莓、葡萄、叶用蔬菜、辣椒及番茄等病害的防治（http：//wwwepagov/pesticides/biopesticides），但还未见关于芽孢杆菌在生姜上应用的研究报道。本研究首次报道了芽孢杆菌和类芽孢杆菌对姜茎基腐病病原菌有明显的拮抗作用，为进一步开展生姜茎基腐病的生物防治提供了依据，对生姜茎腐病的防治有重要的应用潜力。

芽孢杆菌在自然界中具有耐热、耐饥饿、抗紫外线和活性氧等抗逆境能力，同时由于很多芽孢杆菌的抗菌谱广泛，因此被认为是植物病害生物防治理想的资源。目前已经明确的芽孢杆菌产生的抗菌物质包括mycosubtilin、fengycin、bacillomycin等多种成分，这些抗菌成分不但可以抑制真菌

a、b 菌株JK-14对姜茎基腐病病原菌丝体的影响：白色箭头表示畸形，黑色箭头表示菌丝溢缩并形成横隔；c对照；

d、e菌株JK-14对立枯丝核菌菌丝体影响：白色箭头表示菌丝体畸形，黑色箭头表示红褐色沉积物；f对照。

图3 拮抗菌JK-14对病原真菌菌丝体的作用菌丝体生长、孢子萌发和芽管的形成，导致菌丝体畸变、真菌色素的分泌等，而且可以破坏真菌细胞壁和原生质膜，抑制真菌DNA的合成等[20～22]。本研究中发现，Bacillus的JK-14菌株也可使待测真菌的无隔菌丝体出现菌丝溢缩并形成横隔，菌丝体细胞顶端膨大、畸形等类似现象，表明JK-14可能通过类似机制抑制真菌的生长，但详细抑菌机制仍需进一步研究。

致谢：感谢山东农业大学植病系退休教授郑继法先生在细菌生理生化测定等方面给予的指导和帮助，并对其孜孜不倦的敬业精神致以崇高的敬意。参 考 文 献：

[1] 刘振伟，史秀娟生姜茎腐病的研究进展[J]中国植保导刊，2008，28（10）： 12-14

[2] Stirling G R，Turaganivalu U， Stirling A M， et al Rhizome rot of ginger （Zingiber officinale） caused by Pythium myriotylum in Fiji and Australia [J] Australasian Plant Pathology，2009，38（2）：453-460

[3] 元菊丹，冯 凯，曲志才 13种杀菌剂对生姜腐霉茎基腐病菌的毒力测定[J]农药，2011，50（8）： 619-623

[4] Ravindren P N，Nirmal K B Ginger： The Genus Zingiber[M] New York，Washington： CRC Press，2005，308-316

[5] Zhang J X，Xue A GBiocontrol of sclerotinia stem rot （Sclerotinia sclerotiorum） of soybean using novel Bacillus subtilis strain SB24 under control conditions [J] Plant Pathology， 2010， 59（2）：382-391

[6] El-hamshary O I M，Khattab A A Evaluation of antimicrobial activity of Bacillus subtilis and Bacillus cereus and their fusants against Fusarium solani[J] Research Journal of Cell and Molecular Biology， 2008， 2（2）： 24-29

[7] 林加涵， 魏文铃， 彭宣宪 现代生物学实验（ 下册） [M] 北京： 高等教育出版社， 2001，98-103

[8] Gu Ganyu，Leif Smith，Wang Nian，et al Biosynthesis of an antifungal oligopeptide in Burkholderia contaminans strain MS14 [J] Biochemical and Biophysical Research Communications， 2009， 380（4）： 328-332

[9] 杜秉海微生物学实验[M]北京：北京农业大学出版社， 1994

[10] 东秀珠， 蔡妙英 常见细菌系统鉴定手册[ M]北京：科学出版社， 2001

[11] Buchanan R E，Gibbons N E Bergeys manual of determinative bacteriology [M] Beijing： Science Press，1984，729-797

[12] Kim S B，Yoon J H，Kim H，et al A phylogenetic analysis of the genus Saccharomonospora conducted with 16S rRNA gene sequences [J] International Journal of Systematic Bacteriology，1995，45（2）：351-356

[13] Rainey F A，Rainey N W，Kroppenstedt R M，et al The genus Nocardiopsis represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct actinomycete lineage： Proposal of Nocardiopsaceae fam Nov[J] International Journal of Systematic Bacteriology，1996，46（4）：1088-1092

[14] Galkiewicz J P，Kellogg C A Cross-kingdom amplification using bacteria-specific primers： complications for coral microbial ecology[J] Applied and Environmental Microbiology， 2008， 74（3）：7828-7831

[15] Saitou N，Nei M The neighbour-joining method：A new method for reconstructing phylogenetic trees[J] Molecular Biology and Evolution， 1987， 4（5）：406-425

[16] Kim D S， Bae C Y，Jeon J J，et al Paenibacillus elgii sp nov with broad antimicrobial activity[J] International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2004，54（7）：2031-2035

[17] Schisler D A，Slininger P J，Behle R W，et al Formulation of Bacillus spp for biological control of plant diseases [J] Phytopathology， 2004， 94（11）：1267-1271

[18] 朱文静，伍辉军，高学文芽孢杆菌对大豆根腐病防治效果研究[J] 大豆科学， 2011， 30（4）：623-625

[19] 喻国辉，程 萍，王燕鹂，等枯草芽孢杆菌TR21田间防治巴西蕉枯萎病的效果[J]中国生物防治， 2011， 26（4）：497- 500

[20] 郭金鹏，刘晓昌，仝赞华，等芽孢杆菌HSY-8-1对植物病原真菌的抑制及其抑菌产物特性[J]吉林农业大学学报， 2011，32（3）：29-33

[21] Cherif M， Sadfi N，Ouellette G B Ultrastructure of in vivo interactions of the antagonistic bacteria Bacillus cereus X16 and B thuringiensis 55T with Fusarium roseum var sambucinum， the causal agent of potato dry rot[J] Phytopathol Mediterr.，2003，42（3）：41-54

[22] Machado A P， Anzai M， Fischman O Bacillus subtilis induces morphological changes in Fonsecaea pedrosoi in vitro resulting in more resistant fungal forms in vivo [J] The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases，2010，16（4）：592-598 山 东 农 业 科 学 2012，44（11）：90～98