壳聚糖包衣对花生防御酶活性的影响

张廷婷　谷晓红　李春娟　王春玮　闫彩霞　单世华

摘 要：为研究壳聚糖包衣对提高花生抗性的作用机理，本实验用壳聚糖溶液（Chitosan Solution，CS）对不同品种花生种子包衣，测定在萌发阶段花生种子内的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）等主要防御酶活性的变化。结果表明，壳聚糖可明显提高花生种子PAL、PPO、POD的活性，并且不同浓度的壳聚糖溶液包衣促进效果不同，各品种最适合的壳聚糖浓度也不同。表明外源壳聚糖处理可使花生种子防御酶活性增加，增强花生抗病性。

关键词：花生；壳聚糖；防御酶

中图分类号：S565.201 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2012）11-0031-04

Effect of Chitosan Cover on Activities of Defense Enzymes

in Peanut （Arachis hypogaea L.） Seeds

Zhang TingTing1， Gu XiaoHong2， Li ChunJuan1， Wang ChunWei1，3， Yan CaiXia1， Shan ShiHua1*

（1. Shandong Peanut Research Institute， Qingdao 266100， China； 2.Central Laboratory of Shandong Academy of

Agricultural Sciences， Jinan 250100， China； 3. Shandong University at Weihai， Weihai 264209， China）

Abstract In order to study the mechanisms of chitosan cover on increasing the resistance of peanut， different cultivars of peanut seeds were covered with chitosan solution， and then the activity variation of PAL， PPO and POD were determined and analyzed during the germination period. The results showed that the activities of these three enzymes in peanut seeds increased significantly after treated with chitosan. The effect was different with different concentrations of chitosan， and the optimal chitosan concentration for different peanut cultivars was also different. In conclusion， chitosan could increase the activities of defense enzymes in peanut seeds， and then increased the peanut resistance to diseases.

Key words Peanut （Arachis hypogaea L.）； Chitosan； Defense enzyme

壳聚糖（Chitosan，CTS）是天然聚合物，在自然界广泛存在，将其应用于农业生产不会产生任何毒副作用，在土壤中经微生物分解后的最终产物又可被植物吸收，对土壤微环境不会造成不利影响，美国、日本、加拿大等国己有不少报道，国内近几年相关报道也逐渐增多。CTS作为生防农药，可以制成浸种剂、根施剂、喷雾剂、展膜剂等，在抗病诱导、杀菌杀虫、抵御逆境等方面扮演着日益重要的角色[1]，在作物生产上具有广阔的应用前景[2，3]。

Hadwiger等[4]认为，在植物病原菌与寄生植物之间，CTS对植物病原菌的孢子萌发和生长有阻碍作用，并对病原菌感染的防护机能具有诱导作用。赵蕾等[5]研究表明，CTS除了对烟草黑胫病菌（Phytophthora parasitica）有抑制作用外，还能诱导烟草植株的抗病性，诱导效应可达10%～7856%。 壳聚糖包衣还可以改变植物的酚类代谢，Ralph[6]证实，壳聚糖诱导的大豆细胞中酚类组成会迅速变化，如苯丙烷、香豆酸和绿原酸等都明显增加。壳聚糖对过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）也有影响，张燕等[7]用03%～05%的壳聚糖对烟草种子进行浸种处理，发现处理组的幼苗叶片POD活性均高于对照组（未经壳聚糖处理）。部分乙酰化的壳聚糖多聚体可强烈诱导小麦叶片PAL和PPO的活性[8]。PPO和PAL等酶类在植物的抗病反应中起着十分重要的作用[9]。

本研究通过利用不同浓度的壳聚糖溶液（Chitosan Solution，CS）浸泡花生种子，选用引自印度的抗逆性强的花生品种J11、北方花生产区主推品种花育22号以及南方花生产区生产品种仲恺花11号为试验材料，测定包衣后花生种子中与抗性密切相关的三种防御酶活性变化，旨在阐明CS包衣后花生抗性增强的生理机制，为生产中花生抗逆及相关病害防治和抗性育种提供理论基础。

1 材料与方法

11 供试材料

花生品种J11、花育22、仲恺花11号由山东省花生研究所品种资源课题组保存。

所用试剂包括壳聚糖、液氮、硼酸缓冲液（内含5 mmol/L的巯基乙醇，pH 88）、盐酸、L-苯丙氨酸、醋酸、邻甲氧基苯酚、邻苯二酚、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、甲硫氨酸（Met）、四氮唑蓝（NBT）、核黄素（FD）、过氧化氢（30%）、氢氧化钠、三氯乙酸、乙醇。

仪器包括高速冷冻离心机、电子天平、FA/JA系列电子天平、双向磁力加热搅拌器、pH计、快速混匀器、智能型交流净化稳压电源、光照培养箱、超低温保存冰箱、冰柜、气浴恒温振荡器、电热恒温水浴锅、紫外可见分光光度计、恒温培养箱。

12 试验方法

每品种各取种子50粒浸泡于70%的酒精中10 min，取出后用01%HgCl2洗涤3遍，每次1 min，再加无菌水浸泡4 h。然后分别用0、01、05、10、15 g/L的CS溶液进行浸泡包衣处理，1 h后取出晾干，在超净工作台上立即接种于MS0培养基，于35℃培养箱培养，光照2 400 lx。每天取出样本进行酶活力检测。

13 酶活性测定

苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性用苯丙氨酸法[10]，过氧化物酶（POD）活性用愈创木酚法[11]，多酚氧化酶（PPO）活性用紫外分光光度法测定[12]。每样品重复5次，取平均值。

14 酶活单位及计算

以每分钟内OD值变化001为一个酶活单位，按下式计算酶活力：

酶活力（001△OD/min）=（△OD/001t）×D

式中△OD为反应内光密度的变化；t为反应时间（min）；D为稀释倍数。

2 结果与分析

21 CS对花生种子PAL活性影响

从图1看出，不同品种花生种子经不同浓度CS处理后，发芽期间PAL活性在5天内变化较明显。经不同浓度CS处理后，仲恺花11号花生种子的PAL活性提高显著，在测定时间范围内出现明显的峰值，其中05 g/L浓度CS处理后第3天PAL活性提高到最大值，且比对照组高6214%。花育22号在测定时间范围内也出现峰值，然后缓慢下降，最佳的处理浓度在01 g/L左右。J11花生种子PAL活力变化总体较平稳，其中浓度为01 g/L的CS处理后第1天对种子PAL活性促进作用较大，随后有所下降，在第4天时略有提高，然后又下降，总的来说CS处理对J11的PAL活性影响不是很大。

22 CS对花生种子POD活性影响

经不同浓度CS包衣处理之后（图2）， 不同品种花生种子内POD活性均有不同程度提高，三个品种的总体趋势均为先上升后下降。仲恺花11号在CS浓度为1.0 g/L时相对于对照组酶活性提高最明显，在第4天时的提高程度最大，且比对照高2.14倍。花育22号在CS浓度为01 g/L处理后POD活性变化差异较大，在第3天时达49333 U/（min·gFW），比对照高2.96倍。J11种子在CS处理后第2天，POD活性促进作用提高较大，在第4天时各处理浓度的POD活性达到最大，其中CS浓度为01 g/L时最高，比对照高2749%。

注：A，仲恺花11号；B，花育22；C，J11，下图同。

图1 不同浓度CS处理对花生PAL活性的影响

图2 不同浓度CS处理对花生POD活性影响

23 CS对花生种子PPO活性的影响

经不同浓度CS包衣处理之后（图3），各花生品种的PPO活性也有不同程度的变化。仲恺花11号PPO活性变化较明显，呈先升高后降低的趋势，其中1 g/L的CS处理后，第3天PPO活性提高最大，比对照高2倍。花育22经过CS处理后，PPO活性在不同浓度不同时间变化趋势不一致，总体来说，01 g/L CS处理最大程度地提高了PPO活性；J11经不同浓度CS处理后PPO活性变化也呈先升高后降低的趋势，以 01 g/L的CS处理酶促进作用较显著，在第2天时提高到最大，比对照高263%。

图3 不同浓度CS处理对花生PPO活性的影响3 讨论

花生受病原菌诱导后会激活部分防御酶，包括PAL、POD、PPO等，其中PAL参与植保素和木质素的合成，POD可催化木质素前体脱氢氧化，木质素能够提高细胞壁的机械强度和钝化细菌产生的细胞壁降解酶，阻止病原菌侵入扩散。POD还是细胞内重要的内源性活性氧的清除剂。PPO与底物接触，将酚氧化成为棕褐色的醌，后者对病原菌的毒杀能力比较强。

壳聚糖不仅能够抑制多种病原菌的菌丝生长，而且还参与到植物的多种抗病性反应，如几丁质酶的积累[13]、诱导葡聚糖酶的合成[14]以及诱导PAL活性[15]等，从而激发苯丙烷类代谢，产生酚类和异黄酮类抗毒素作用；诱导产生病程相关蛋白（pathogenesis related proteins，PR蛋白）[5，6，16]。此外，壳聚糖等甲壳素衍生物对许多植物病原真菌有一定程度的直接抑制作用[8]。壳聚糖本身的成膜性也阻碍了病原菌与寄主组织或细胞的直接接触，减少了病原菌的有效侵入。

本试验结果表明，用适宜浓度的壳聚糖溶液（CS）包衣花生种子，在一定程度上会提高花生自身PAL、POD、PPO等酶的活性，从而提高植物自身抗病性，对农作物提高抗性具有重要的实践意义。参 考 文 献：

[1] 于汉寿，吴汉章，杨 冰 壳聚糖抑制植物病害的研究进展[J]天然产物研究与开发，2003，12（3）：94-97

[2] 石 磊，王世平，顾介明 不同浓度壳聚糖膜对葡萄保鲜效果的研究[J] 山东农业科学，2009，8：99-101

[3] 林春梅 壳聚糖黏均分子量的测定[J]山东农业科学，2011，7：105-106

[4] Hadwiger L A， Beckman J M， Adams M J Localiztion of fungal components in the pea-fusarium interation detected immunochemically with anti-chitosan and anti-fungal cell wall antisera[J] Plant Physiol，1981，67：170-175

[5] 赵 蕾，梁元存，刘延荣壳聚糖对烟草抗黑胫病的作用[J]应用与环境生物学报 ，2000，6（5）：436-439

[6] Ralph L，Nicholson，Raymond H.Phenolic compounds andtheir role in disease resistance[J].Annu Review Phytopathol，1992，30：369-389

[7] 张 燕，方 力，王 宝壳聚糖对烟草种子萌发及幼苗生理生化特性的影响[J] 吉林农业大学学报，1998，20（3）：28-30

[8] Vander P，Varum K M， Domard A， et al Comparison of the ability of partially N-acetylated chitosans and chitooligosaccharides to elicit resistance reactions in wheat leaves[J]Plant Physiol， 1998，118： 1353-1359

[9] 李洪连，汪守正，王金生，等黄瓜对炭疽病诱导抗性的初步研究Ⅱ诱导抗病机制的研究[J]植物病理学报，1993，23（4）：327-332

[10] 王 涛，雷关红，曹辰兴，等 温室白粉虱对无毛黄瓜叶PAL、PPO、POD活性的影响[J] 山东农业科学，2011，9：81-84，87

[11] 孙淑琴，李荣华，杨秀荣，等 草坪草褐斑病菌粗毒素液对寄主叶片防御酶体系的影响[J] 山东农业科学，2012，44（1）：87-90

[12] 中国科学院上海植物生理研究所编现代植物生理学实验指南[M]北京：科学出版社，1999

[13] Hirano S， Nagao N Effects of chitosan， petic acid， lysozyme， and chitosanase on the growth of several phytopathogens[J]Agric Biol Chem，1989，53（11）：3065-3066

[14] Benhamou N， Kloepper J W， Tuzun SInduction of resistance against Fusarium wilt of tomato by combination of chitosan with an endophytic bacterial strain： ultrastructure and cytochemistry of the host response [J] Planta， 1998， 204（2）：153-168

[15] Pospiesny H Antiviroid activity of chitosan[J] Crop Protection， 1997， 16（2）： 105-106

[16] 曾泳三，王振中苯丙氨酸解氨酶在植物抗病反应中的作用[J]仲恺农业技术学院学报，1999，12（3）：56-65 山 东 农 业 科 学 2012，44（11）：35～37