人牙周细胞压力作用下Hif—1 alpha及Rankl/Opg变化

郭莉　徐静　郭宏刚

[摘要]目的：探讨过大压力对人牙周膜细胞三维微球中Hif-1 alpha和Rankl/Opg表达的影响。方法：体外构建人牙周膜细胞三维微球，压力组给予0.2 MPa， 4 h静态压力，对照组不给予额外压力，实时定量PCR检测Hif-1 alpha、Rankl和Opg表达。结果：压力组人牙周膜细胞微球Hif-1 alpha和Rankl mRNA 表达增加，而Opg mRNA表达降低。结论：过大压力可以使人牙周膜细胞上调Hif-1 alpha并且升高Rankl/Opg mRNA比值，使其分泌的因子向促破骨方向发展。

[关键词]人牙周膜细胞微球；压力；Hif-1 alpha ；Rankl/Opg

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）11-1964-03

牙周炎是口腔疾患中的常见疾病，牙槽骨吸收是其的主要临床表现之一，严重者可导致牙齿松动或脱落。在引起破骨过程中，Rankl/Opg之间的平衡起着主要作用，Rankl作为分泌性因子与破骨前体细胞或破骨细胞膜上表达的Rank受体结合而诱导破骨细胞的分化、成熟和破骨功能，而Opg是分泌性同Rankl结合的假受体，其与Rankl结合而抑制破骨活动[1]。

体内实验及体外人牙周膜细胞二维培养实验等提示人牙周膜细胞可能是Rankl/Opg来源而影响牙周炎中牙槽骨的改建[2-7]。咬合创伤常常是牙周炎的协同致病因素，过大的咬合力量导致牙槽骨吸收，体外试验也显示人牙周膜细胞能够感受机械信号而调节Rankl/Opg表达[8-14]。Hif-1 alpha是细胞感受乏氧的重要转录因子[15]，外界力学信号也可以改变其表达[17-19]，而最近研究表明Hif-1 alpha可以直接诱导Rankl的表达[20]。

采用高密度细胞自行在非贴壁的琼脂孔内形成无支架的三维细胞块已经用于软骨和纤维软骨的组织工程研究[21-22]，本研究采用高密度的人牙周膜细胞微球三维培养和压力加载系统观察压力对Hif-1 alpha和Rankl/Opg的影响，以其模拟过大咬合力对牙周膜细胞在牙槽骨改建中的作用。

1材料和方法

1.1 人牙周膜细胞的分离培养：参考[23]的方法，无菌条件下刮取健康男性正畸拔牙的双尖牙牙根表面中1/3的牙周膜，以组织块酶消化法得到原代人牙周膜细胞。牙周膜细胞常规培养于含20%胎牛血清的DMEM。待细胞汇聚80%左右后，0.25%胰酶消化传代。P3代的人牙周膜细胞用于构建细胞微球。

1.2 人牙周膜细胞微球的构建和加压：参照Johns 等[21]的方法，先将消毒融化的2%的琼脂糖注入到24孔板的孔内，然后将粘有24个直径5mm×高10mm的不锈钢圆柱体盖板适合于24孔，琼脂糖在室温下1h左右结成凝胶，分离附有不锈钢圆柱体的24孔板盖板，形成24孔直径5mm×高10mm的琼脂孔，琼脂孔被完全培养液饱和置换出琼脂糖内含的PBS。每孔把2×106个P3代人牙周膜细胞悬于100μl完全培养基中，细胞不能贴壁于琼脂糖孔，也不能长入其中，琼脂孔内每天换液50μl， 1w后细胞将自行聚集形成将人牙周膜细胞微球。

压力装置采用任利玲等[24]的加压系统，将人牙周膜细胞微球置于加有完全培养基5 ml注射器中，注射器固定在超净台内中的加压装置上，维持于37℃恒温水浴箱中。注射器通过活塞运动压缩空气产生静水压作用于人牙周膜细胞微球。将形成的人牙周膜细胞微球随机分成两组：压力组给予0.2 MPa， 4h的静态压力，对照组给予4h除不加力外，其它培养条件同加压组，加力后进行大体观测，每组设4个样本。

1.3 实时定量RT-PCR检测Hif-1 alpha和Rankl/Opg的表达：将加力后的人牙周膜细胞微球用Trizol试剂盒（Invitrogen， Carlsbad， CA， USA）提取总RNA， 按照PrimeScriptR RT Master Mix （Perfect Real Time， Takara， 大连）反转录试剂盒反转录成cDNA，实时定量按照PCR SYBRR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time， Takara， 大连）试剂盒利用Applied Biosystems 7500 PCR系统。目的基因的引物序列如下：Hif-1 alpha上游引物： GCTGGCCCCAGCCGCTGGAG，Hif-1 alpha下游引物： GAGTGCAGG GTCAGCACTAC； Rankl上游引物： CGTTGGATCACAGCACATCAG， Rankl下游引物： GTACCAAGAGGACAGACTCAC； OPG上游引物：CACTACTACACAGACAGCTGG， Opg下游引物：ACTCTATCTCAAGGTA GCGCC； Gapdh上游引物：GTCTTCACCACCATGGAGAAG， Gapdh下游引物： GTTGTCATGGATGACCTTGGC。所以基因重复3次，对其结果取均值，目标基因采用2-△△Ct相对定量的方法，将对照组目的基因设为1，压力组与对照组比较得到相对定量值。

1.4 统计分析：所得数据以x±s表示，SPSS 16.0进行单因素方差分析，选取α=0.05。

2结果

2.1 加压后的人牙周膜细胞微球大体情况：图1代表性显示构建好的人牙周膜细胞微球呈大约1mm球样形态，加压组和对照组大体观没有明显差异。

2.2 加压后的人牙周膜细胞Hif-1 alpha和Rankl/Opg的mRNA表达：人牙周膜细胞微球施加4h0.2Mpa持续压力后Hif-1 alpha mRNA水平显著性上调，是对照组的2.7倍左右。受压以后人牙周膜细胞的Rankl mRNA也明显上调，而Opg mRNA却少许下降，反应破骨功能的Rankl/Opg mRNA水平的比值因此在加压组明显上升，约是对照组的2.2倍。Rankl/Opg比值的上升，说明0.2MPa持续压力使人牙周膜细胞分泌的因子向促破骨方向发展。

3讨论

本研究结果显示，0.2Mpa的持续压力会引起人牙周膜细胞微球Hif-1 alpha和Rankl的mRNA 表达增加，而抑制Opg mRNA的表达，从而Rankl/Opg mRNA比值升高，使人牙周膜细胞分泌的因子向促破骨方向发展。

Hif-1 alpha即缺氧诱导因子-1 alpha，在体内实验发现过大机械刺激会使软骨细胞中Hif-1 alpha表达增高[19]，而体外机械力作用肌腱成纤维细胞也会上调其表达[17]。最近体外报告基因实验显示Hif-1 alpha可以直接上调Rankl[20]，进一步提示Hif-1 alpha转录因子可能通过调节Rankl的分泌而影响破骨活动。这与本研究的结果一致，0.2MPa可能代表过大的咬合力，从而使人牙周膜细胞微球的内环境改变而影响Hif-1 alpha的上调，提示它可能与促进Rankl表达增高有关。

牙槽骨的严重吸收是牙周炎晚期的主要表现，而牙周膜细胞分泌的Rankl/Opg是调节破骨细胞功能的一对重要因子。体内外实验提示牙周膜细胞分泌的Rankl/Opg的比值增加可能与牙周炎密切相关[2-7]。本研究发现0.2MPa持续压力可以促进Rankl表达而一致Opg表达，从而有利于破骨，这与大多数体外机械刺激牙周膜细胞的结论一致[8-14]，可能是过大压力原因，而其他的研究者发现合适的机械刺激也会抑制牙周膜细胞的破骨因子分泌[25-26]。本研究采用纯牙周膜细胞微球的三维培养[21-22]和压力装置[23]，较体外单层培养有一定的优势，虽然不能用来研究牙周膜细胞和破骨细胞共培养，这与Bloemen 等[2]的研究成纤维细胞对破骨细胞影响的方法不一样，但是牙周细胞微球加压后的条件培养液可以用于体外模拟牙周膜细胞分泌的因子对破骨细胞功能的研究，这尚需进一步研究。

纵上所述，异常的机械压力可能上调人牙周膜细胞的Hif-1 alpha和Rankl而抑制Opg表达而发挥促破骨功能，这可能是导致晚期牙周炎牙槽骨吸收的原因之一，而其具体机制尚需深入研究。

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[收稿日期]2012-08-11[修回日期]2012-10-10

编辑/张惠娟