氨甲喋呤对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

张建军　陈发国　吴毅平

[摘要]目的：探讨氨甲喋呤对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成的影响。方法：以体外培养的人瘢痕成纤维细胞为实验模型，将氨甲喋呤（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L）加入细胞培养液中进行干预并与空白对照组比较，用乳酸脱氢酶实验检测药物的细胞毒性，并通过MTT实验和羟脯氨酸测定实验分别检测药物对成纤维细胞增殖活性和胶原合成的影响。结果：10-6mol/L、10-5mol/L的氨甲喋呤对成纤维细胞的生长有抑制作用，与对照组比较差异有显著性（P<0.01），10-9mol/L～10-5mol/L的氨甲喋呤对瘢痕成纤维细胞胶原合成具有抑制作用（P<0.01）。结论：氨甲喋呤在体外对瘢痕成纤维细胞细胞增殖和胶原合成具有抑制作用。

[关键词]氨甲喋呤；增生性瘢痕；成纤维细胞；细胞增殖；胶原合成

[中图分类号]R619+.6[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）11-1961-03

增生性瘢痕是多种致伤因素对真皮组织作用后创面异常愈合的不良结局，不仅可伴有疼痛、瘙痒等不适症状，过度的增生还可以造成机体外形改变和功能障碍，进而影响患者的生活质量，对患者生理和心理造成损害，临床治疗效果目前多不令人满意[1]，如何防治瘢痕的形成，一直是近年来的研究热点之一。病理性瘢痕的形成机制异常复杂，已有的研究提示[2]：它是一个多种因素作用下的纤维化过程，其中（肌）成纤维细胞的异常增殖以及其胶原的过度合成在其中发挥了重要的作用，已成为人们选择治疗的重要靶点。因此，从抑制成纤维细胞增殖和胶原代谢的方面寻找治疗和预防瘢痕增生药物具有重要意义。氨甲喋呤具有抗增殖和免疫抑制的双重药理作用，在对纤维化皮肤病诸如侵袭性纤维瘤[3]的治疗中也发挥了一定的治疗作用。我们通过以体外培养的增生性瘢痕成纤维细胞作为实验对象，观察氨甲喋呤对瘢痕成纤维细胞增殖及胶原合成的影响，为探讨氨甲喋呤在治疗增生性瘢痕方面的临床应用价值提供实验和理论依据。

1材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验药物：氨甲喋呤：DMEM溶解后滤过除菌（0.2μm滤膜），配制成10-3mol/L浓度母液，置-20℃冰箱避光保存，贮存备用。临用时用无血清DMEM分别稀释成0、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L[4]。

1.1.2主要仪器和试剂：DMEM：美国Gibco公司；MTT、胰蛋白酶：华美公司；小牛血清：浙江三立公司；DMSO上海Sangon公司；羟脯氨酸试剂盒：南京建成生物制品有限公司。OLYMPUS-IX71型倒置相差显微镜（日本）、Form Scientific CO2孵箱（美国）、BIO-RAD550型酶联免疫检测仪（美国）、HITACHI7176S型全自动生化分析仪（日本）、TU-1800紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。

1.1.3标本来源：增生性瘢痕成纤维细胞来源于手术中切下的增生性瘢痕，共3例（女2，男1）， 年龄1～25岁，取材部位分别为手部、颈部、髂腰部，病程分别为10个月、12个月、13个月，近期无使用瘢痕治疗药物史，不伴有肿瘤或其它严重疾病。

1.2 实验方法

1.2.1人成纤维细胞培养：用组织块法[5]进行成纤维细胞培养：无菌条件下进行漂洗、剪碎，接种于含10%新生牛血清（NCS）的DMEM培养液中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的CO2孵箱中培养。待细胞从组织块中长出并接近融合成单层时用0.125% 胰蛋白酶消化， 1： 2 传代。本实验所用细胞为4～6代。实验按照药物浓度分为空白对照组0（为不含药物的DMEM培养液）和实验组：10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L。

1.2.2 乳酸脱氢酶（LDH） 的测定：取4～8代对数生长期细胞，血细胞计数板计数，用含10%NCS的DMEM培养液调整细胞密度为2.5×104/ml，用24孔培养板培养，每孔接种1ml即2.5×104个细胞，置CO2孵箱内培养24h，每一药物浓度组及相应对照组均设6个复孔，按实验药物分组加入条件培养液1ml，继续培养24h，取上清，用全自动生化分析仪测定LDH活性值。

1.2.3 MTT比色法测定细胞增殖状况：MTT法参照Hansen[6]的方法略作修改，取4～8代对数生长期细胞，血细胞计数板计数，用含10%NCS的DMEM培养液调整细胞密度为5×104/ml，用96孔板培养，每孔加入100μl即5×103个细胞，置CO2孵箱中培养24h，吸弃上清，每一药物浓度组及相应对照组均设8个复孔，2个无细胞对照孔，按实验药物分组加入条件培养液100μl，继续培养24h，吸弃上清10μl加入MTT液10μl/孔（MTT5g/L）继续培养4h，弃上清，每孔加入DMSO100μl，振荡10min，使结晶充分溶解，自动酶联免疫分析仪测定吸光度A（波长570nm）。

1.2.4 细胞分泌胶原含量的测定[7]：将细胞接种于24孔培养板，细胞密度5×104/ml，每孔加入1ml培养基，接种48h后更换条件培养液，每一药物浓度组设计6个复孔。药物作用48h，从每孔各吸取0.5ml培养基，按羟脯氨酸（HPr）检测试剂盒说明书方法，测定培养基中HPr含量。用紫外可见分光光度计550 nm检测培养基中A值，测定HPr的含量，样品中HPr的质量浓度（μg/ml）=（（测定管A值-空白管A值）/（标准液A值-空白管A值））×标准管质量浓度（2μg/ml）；样品中胶原的浓度（μg/ml培养基）=样品中羟脯氨酸浓度×7.46×稀释倍数（7.46是从羟脯氨酸换算为胶原时的计算常数）。

1.3 统计学处理：采用SPSS18.0统计软件进行多个实验组与同一对照组的比较的方差分析，数据用x±s表示，P<0.05示差异有显著性。

2结果

2.1 药物对细胞的毒性作用：氨甲喋呤作用24h后，10-9mol/L、10-8mol/L浓度氨甲喋呤培养上清中LDH活性与对照组比较差异均无显著性（P>0.05）；而10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L浓度氨甲喋呤与空白对照组比较，结果差异均有显著性 （P<0.01）（见表1）。提示：高于10-7mol/L浓度的氨甲喋呤均表现出对增生性瘢痕成纤维细胞的细胞毒性作用。

2.2 药物对细胞增殖的影响：10-6mol/L、10-5mol/L浓度氨甲喋呤药物组分别与空白对照组比较差异均有显著性（P=0.000），而10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L浓度氨甲喋呤药物组分别与对照组比较差异均无显著性（P>0.05）（见表2）。提示：高于10-6mol/L浓度的氨甲喋呤能显著抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖，而低于10-6mol/L浓度的氨甲喋呤却未表现出此抑制作用。

2.3 药物对瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响：各浓度氨甲喋呤药物组与空白对照组之间差异均有显著性（P<0.01）（见表3）。提示：10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L浓度的氨甲喋呤均抑制了增生性瘢痕成纤维细胞胶原蛋白的合成。

3 讨论

成纤维细胞在瘢痕形成过程中起着至关重要的作用，它是形成肉芽组织、合成胶原等细胞外基质、进行伤口重塑的重要细胞[2，8]，成纤维细胞的异常增殖和过度合成或分泌胶原蛋白的功能受到普遍关注。

氨甲喋呤对增生性瘢痕中成纤维细胞是否有直接作用，目前还尚未见到文献报道。MTT法是目前常用的检测细胞增殖和活力的方法，可以通过吸光度值的高低反映活性细胞的浓度。本试验MTT比色法结果显示10-6mol/L、10-5mol/L浓度药物组的吸光度值较对照组有一定程度的下降，与对照组有显著性差异（P<0.01），提示10-6mol/L、10-5mol/L浓度的氨甲喋呤对成纤维细胞的增殖有一定的抑制作用，这与安振梅报道的氨甲喋呤对人眼球后成纤维细胞增殖的抑制作用结果基本一致[9]。

乳酸脱氢酶是所有细胞的胞浆内均存在的细胞内酶，细胞膜受损时可迅速释放到细胞外，故可作为细胞毒性检测的一项敏感指标。我们测定了细胞上清液中的LDH值，结果氨甲喋呤作用24h后，10-9mol/L、10-8mol/L浓度氨甲喋呤培养上清中LDH活性与对照组比较差异均无显著性（P>0.05）；而10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L浓度氨甲喋呤与空白对照组比较，结果差异均有显著性（P<0.01）（见表1）。提示：高于10-7mol/L浓度的氨甲喋呤均可能损伤了部分瘢痕成纤维细胞的细胞膜，而表现出其细胞毒性作用。

羟脯氨酸是胶原蛋白中特有的氨基酸，含量相对恒定，占胶原中总氨基酸的13.4%，而一般蛋白质含量极微，故羟脯氨酸的测定值可间接反映胶原蛋白的合成情况。我们的实验检测了细胞上清液[7]中的羟脯氨酸的含量，结果显示：在本实验条件下，10-9mol/L～10-5mol/L浓度的氨甲喋呤可使细胞上清液中的羟脯氨酸含量显著降低（P<0.01），据此计算出的胶原蛋白含量，与对照组相比呈显著性降低（P<0.01），这间接反映出对增生性瘢痕成纤维细胞的胶原合成的抑制作用。另外，在本实验结果中10-9mol/L～10-7mol/L浓度的氨甲喋呤虽然并未表现出对成纤维细胞的抑制作用，但却抑制了胶原的合成，也提示氨甲喋呤可能存在的临床应用前景。

氨甲喋呤是一种有效的抗肿瘤药物，它是二氢叶酸还原酶抑制剂，可阻止二氢叶酸向四氢叶酸转化，使细胞DNA合成障碍，干扰RNA和蛋白质的生物合成，其主要作用于S期细胞，尤其对于处于对数增殖期的细胞作用最强，我们选取的瘢痕成纤维细胞处于增殖旺盛的对数生长期，体外实验中氨甲喋呤对增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原合成的抑制作用机制可能与此有关。另外，氨甲喋呤对细胞增殖的调控也可通过诱导细胞凋亡发挥作用[4]，我们通过MTT、LDH测定实验结合显微镜下观察发现，10-6mol/L、10-5mol/L浓度的氨甲喋呤影响了细胞的活性，对部分细胞的细胞膜产生了损伤，但这部分成纤维细胞究竟是发生了坏死还是凋亡目前还不清楚，需要通过进一步实验来确定。

氨甲喋呤被用于儿童并指畸形术后瘢痕疙瘩的预防和治疗，疗效满意[10]，但未见到氨甲喋呤治疗增生性瘢痕的报道。结合本实验结果，氨甲喋呤虽然在体外可抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原合成，临床治疗瘢痕疙瘩也发挥了治疗作用，但其潜在的治疗增生性瘢痕的作用可能会由于它的细胞毒性作用而受到一定的限制。

氨甲喋呤作为一种免疫抑制剂，临床用于治疗硬皮病[3，11]、难治性的牛皮癣、结节病和类风湿关节炎[12]。瘢痕增生过程中局部免疫反应活跃，氨甲喋呤是否可通过抑制局部增强的免疫反应来间接调控增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原合成，促进瘢痕的消退，需要今后的实验去证实。

本实验结果提示，氨甲喋呤一方面可直接抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖，另一方面可减少胶原蛋白的生成。因此可以推测该药在防治增生性瘢痕方面可能具有潜在的应用价值。

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[收稿日期]2012-07-26[修回日期]2012-10-15

编辑/张惠娟