腋臭患者ApoD表达变化及其分子机制的研究

陈辉 颖利　杜洁　王芳芳

[摘要]目的：观察与E-3M2H分泌相关的载脂蛋白D（ApoD）和雄激素受体AR在腋臭患者的大汗腺的表达与正常人的差异，探讨导致腋臭患者ApoD表达异常的原因。方法：收集4例正常对照和10例腋臭患者的组织样本，采用免疫组化、realtime-PCR和western-blot检测腋臭患者组织中ApoD、AR的表达水平，通过细胞培养和激素诱导，分析AR信号调控ApoD表达的可能性，并阐明JNK1信号通路在其中扮演的作用。结果：实验发现ApoD和AR在腋臭患者的大汗腺的表达与正常人有明显的差异，腋臭患者中ApoD表达几乎是正常人的2倍；而腋臭患者中AR表达也明显增加，与此同时，腋臭患者中JNK1活化增强。雄激素可以增强正常人ApoD的表达，且该过程中同样伴有JNK1活化；抑制JNK1活化，可以降低腋臭患者和雄激素诱导的ApoD的表达。结论：ApoD表达增加是腋臭患者的重要分子特征，其表达增加与AR 信号增强密切相关。JNK1的活化是腋臭患者和雄激素导致的ApoD表达增加的重要原因，抑制JNK1活化，可以抑制腋臭患者内源和雄激素诱导的ApoD的表达。

[关键词]腋臭；载脂蛋白D（ApoD）；JNK；表达调控

[中图分类号]R758.74[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）11-1956-05

腋臭是整形美容外科的常见病，给患者带来很大的精神和心理压力，影响正常的生活和工作。目前治疗腋臭的方法很多，治疗效果多不相同，具有一定的创伤和并发症。进一步阐明腋臭发生的分子机制，在深入认识腋臭发生病理机制的同时，有望发现无创治疗腋臭的新手段，对腋臭治疗具有重要的意义。研究表明，（E）-3-甲基-2-已烯酸（E-3M2H）的分泌在腋臭发生过程中具有重要作用，而载脂蛋白D（ApoD）是调控其分泌的重要分子。然而，腋臭患者中ApoD的表达情况及其与腋臭的关系尚不清楚。深入分析腋臭患者中ApoD的表达及其机制，对于认识腋臭的发生具有重要的意义。本研究将集中探讨腋臭患者AR和ApoD的表达变化及其相关性；分析AR信号是否可能调节大汗腺中ApoD的表达，特别是JNK1信号在其中扮演的可能角色。

1材料和方法

1.1 临床样本收集：收集2009年10月到2010年5月在第四军医大学唐都医院整形激光美容中心手术治疗腋臭的男性患者腋下组织标本10例，同时募集4例男性志愿者（瘢痕修复患者或其他原因）。术中取患者左右两侧腋下新鲜皮肤组织约6cm×0.3cm×0.3cm（深及脂肪层）。

1.2 细胞培养：取自患者和志愿者的腋窝处皮肤经D-Hanks液冲洗后，剔除脂肪组织。用眼科手术剪将皮肤剪成1mm3的小组织块。然后用II型胶原酶孵箱中消化1天。1天后，镜下获取汗腺组织，移入新的培养瓶中培养，加入少许培养基，待汗腺组织块贴壁后继续加入2ml培养基继续培养。 每2～3天换液一次。通常汗腺上皮中混有成纤维细胞，而后者与汗腺上皮相比，贴壁较差。 为了纯化汗腺上皮细胞，通过胰酶分步消化的方法获取汗腺上皮细胞。胰酶消化后，首先脱落的是成纤维细胞，吸弃后，继续消化依然贴壁的汗腺上皮，则能获取较为纯的汗腺上皮细胞。整个过程中，细胞培养采用DMEM+10% FBS。

1.3 细胞处理

1.3.1 JNK抑制剂处理：将上述培养的腋臭患者细胞铺板于6孔板，隔夜培养，待细胞长至70%后给予JNK抑制剂处理，抑制剂浓度为10-6M，继续培养24h后，收集细胞用于基因表达检测。

1.3.2 5α-DHT处理：将培养的正常人细胞铺板于6孔板，隔夜培养，待细胞长至70%后给予5α-DHT 处理，剂量分别为10-7M 和10-6M 。此外，我们还在10-6M 浓度的5α-DHT基础上联合添加JNK抑制剂处理，抑制剂浓度为10-6M，继续培养24h后，收集细胞用于基因表达检测。

1.4 Western Blot检测目的基因表达

1.4.1 收集蛋白样品（Protein sample preparation）：将处理完的细胞，PBS洗涤后，按每孔加入80μl的RIPA蛋白裂解液，冰上孵育30min。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，采用Pierce 公司的BCA蛋白定量试剂盒测定每个蛋白样品的蛋白浓度。将适量浓缩的5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液加入收集的蛋白样品中。沸水浴加热3～5min，以充分变性蛋白，离心后取上清备用。

1.4.2. 电泳（Electrophoresis）：首先配制SDS-PAGE凝胶，制备好后，把蛋白样品上样到SDS-PAGE胶加样孔内。为便于观察电泳和转膜效果、判断蛋白分子量大小，在边缘加样孔中加入预染蛋白质分子量Marker。

1.4.3 转膜（Transfer）：本实验中使用硝酸纤维素膜（NC膜）进行转移。转移条件为：电流为200mA，转膜时间为120min。整个过程在冰浴中进行。根据预染蛋白质分子量Marker，判断转膜的效果。

1.4.4 封闭（Blocking）：转膜完成后，即刻把蛋白膜放到预先准备好的Western洗涤液TBST中，漂洗1～2min，洗去膜上的转膜液。吸尽洗涤液后，加入含有10%的脱脂牛奶的Western封闭液，放置于摇床上缓慢摇动，室温封闭120min。

1.4.5 一抗孵育（Primary antibody incubation）：按照预染Marker的指示，将目的基因所在位置的条带剪下。参照一抗的说明书，按照合适比例用TBST稀释一抗，达到合适浓度。用微型台式真空泵吸尽封闭液，即刻加入稀释好的一抗4℃孵育过夜。

1.4.6 二抗孵育（Secondary antibody inucubation）：参照二抗的说明书，按照合适比例，用TBST稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。 二抗时需要根据一抗进行选择。例如一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需要选择抗小鼠IgG的二抗，比如用辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG。

1.4.7 蛋白检测（Detection of proteins）：采用碧云天的BeyoECL Plus ECL类试剂检测蛋白。压片采用专用的压片暗盒（FFC58/FFC83）进行。 用显影定影试剂盒（P0019/P0020）配制显影液和定影液，自行手工洗片。X光片选用柯达原装的生物实验专用柯达X-OMAT BT胶片。

1.5 免疫组化检测目的基因表达

1.5.1配制试剂

1.5.2 操作流程：脱蜡和水化；高压热修复抗原；组织切片染色；脱水、透明、封片、镜检、照相。

1.6 荧光定量PCR检测目的基因表达

1.6.1 提取高质量的RNA：因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，在实验过程中要防止RNA的降解，整个过程在冰上完成。具体步骤略

1.6.2 琼脂糖凝胶电泳RNA，分析提取RNA的质量：配制1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶；取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，确定可见28S和18S 两条明亮条带，而无DNA条带污染。

1.6.3 RNA反转录为cDNA。紫外分光光度计RNA定量。反转录体系（略）。

1.6.3.1 引物设计：由于本实验采用SYBR Green I做 Real Time PCR，引物设计满足特定的要求。由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。本研究用的看家基因为GAPDH。

1.6.3.2 引物质量检测：取0.2ml薄壁PCR管，向各管中加入含染料2×PCR TaqMix10μl；加入正反向引物各0.5μl（引物浓度10μM），向管中加入混合的cDNA各1μl。各管补加水至20μl。混匀，置于AB7500PCR仪中进行PCR反应。反应条件为：95℃ 5min；95℃15s，60℃34s，40cycles；加溶解曲线； 4℃终止反应。

设计的引物的溶解曲线见图1、2。两对引物的溶解曲线均单一，表明产物特异，可以用于下一步实验。利用相对定量的方法分析目的基因表达量的情况，计算表达差异， 采用2-△△CT方法分析基因表达相对变化。

2结果

2.1 大汗腺的形态学观察：大汗腺的分泌活动有可能在机体内环境和外部因素的变化下，在活跃期和静息期之间往复循环。我们对大汗腺的形态学研究发现在腋臭标本和正常标本切片中均可以看到各种分泌时期的大汗腺，但对照组的大汗腺组织明显少于腋臭组，有的切片几乎没有。分泌活跃期的大汗腺管腔小，细胞呈柱状并且顶部凸出到管腔中央形成帽状物，有的已经脱离大汗腺游离到管腔中央（图3）。分泌静息期的大汗腺管腔大，细胞呈扁平状，没有凸出到管腔的分泌物（图4）。

2.2 ApoD、AR免疫组织化学结果：腋臭组大汗腺细胞浆内可见密集分布的棕黄色深染颗粒，ApoD的表达呈强阳性（图5）。正常对照组大汗腺细胞浆内仅见少量棕黄色浅染颗粒，ApoD表达呈弱阳性（图6）。ApoD在腋臭组大汗腺中的表达高于对照组。正常对照组中大汗腺细胞核内仅有少量棕黄色浅染颗粒，AR的表达呈弱阳性（图7）；而腋臭组大汗腺细胞中可见核内密集分布的棕黄色深染颗粒，AR的表达呈强阳性（图8）。

2.3 Real-time检测ApoD的表达差异：我们提取了10例腋臭的男性患者和4例正常对照的腋下组织标本，对其中ApoD的表达进行了检测。结果发现，4例正常对照中ApoD表达水平相对较低，而10例腋臭患者中ApoD的表达水平则比较高。腋臭患者中ApoD的平均表达水平是正常的2倍左右 （图9）。秩检验发现二者有统计学差别。

2.4 腋臭患者JNK1活化增强：对上述14例样本进行蛋白表达检测也发现类似的结果。同时，我们检测了JNK1的表达和活化情况。结果发现，JNK1表达在正常和腋臭患者之间没有显著差别，而腋臭患者中JNK1的磷酸化明显增强（图10），表明腋臭患者中JNK1的磷酸化明显增强，提示增强的JNK1信号可能是腋臭发病的重要分子事件。

在上述研究的基础上，我们进一步探讨了抑制JNK1信号，能否减少ApoD的表达。为此，我们培养了腋臭患者的汗腺细胞。将培养的细胞铺板于6孔板后，给予JNK1抑制剂SP600125处理。结果发现，JNK1抑制剂能够有效地抑制JNK1的磷酸化和ApoD的表达水平（图11），提示JNK1是ApoD表达增加的重要原因。

为了进一步分析JNK1调控ApoD表达究竟是发生在蛋白水平，还是RNA水平。我们又进一步分析了ApoD的RNA表达水平。RT-PCR检测发现，JNK1抑制剂同样能够有效抑制ApoD的RNA表达水平（图12）。表明JNK1是通过调控ApoD的转录影响ApoD的表达的。

先前的研究发现，AR可以调控JNK1的活化；而JNK1同样可以促进AR的转录活性。为此，我们进一步探讨了AR信号是否通过影响JNK1的活化调控ApoD的表达，还是其他信号引起JNK1活化，后者引起AR转录活性增强，进而引起ApoD表达增强。培养正常人汗腺细胞后，给予10-7M、10-6M的5α-DHT刺激。24h 5α-DHT刺激，浓度依赖的增强ApoD的表达，而JNK1则能一定程度的抑制ApoD的表达增加 （图13）。所有这些证据提示AR信号可以以JNK1依赖和非依赖两种方式调控ApoD的表达。

在RNA水平，我们观察到类似的现象（图14）。5α-DHT浓度依赖的增强ApoD的mRNA水平，而JNK1则能一定程度的抑制ApoD的表达增加。

3讨论

腋臭是一种常见病，汉族人的发病率是4.56%[1]，有家族遗传性[2]。该病的确切发病机制尚不明确，近年来的研究[3]认为与大汗腺分泌功能异常有关，大汗腺细胞在腋臭发生中起重要的作用。已有研究[4]证明大汗腺分泌物气味结合蛋白（aprocrine secretion odor-binding protein， ASOB）与腋臭重要气味分子E-3-甲基-2-已烯酸（E-3-methyl-2- hexenoic acid E-3M2H）的分泌相关。臭味的主要成分是E-3M2H，其中也有一定量的挥发性硫化合物[5]。性激素对腋臭有一定调控作用[6]，所以此病高发于青春期。Kurata等人的实验研究表明，腋部大汗腺是雄激素受体（androgen receptor，AR）的靶器官[7]。Beier等[6]指出大汗腺的细胞核中有雄激素受体的表达，这种表达无性别差异。人大汗腺中的ASOB有两种形式：ASOB1和ASOB2[8]，ASOB2在气味的运输过程中起主导作用[9]。E-3M2H在细胞质中同ASOB2分子的N-末端的谷氨酰胺残基以共价键结合形成复合物，该复合物由ASOB2分子运输到皮肤表面后被细菌分解成化合物E-3M2H和3羟基-3甲基已酸（HMHA）和谷氨酰胺（Gln），从而产生特殊的臭味。但也有报道，在无菌条件下培养的大汗腺细胞也可以产生特殊的臭味[10]。AR和ASOB间有着复杂的调控关系，也是腋臭发生机制中的重要环节，我们也从形态学和蛋白水平研究了AR和ASOB在大汗腺细胞中的表达及其相关性，还有待从基因水平进行研究和验证。E-3M2H的分泌增加是腋臭发生的重要分子基础，而ApoD是调节E-3M2H分泌的重要基因。

综上可见，E-3M2H的分泌多少是腋臭发生的起始因素，而ApoD基因自身及其调控因素的差异可能是疾病发生的原因。性激素通过其受体调节基因的活性，调控ApoD表达，参与重要生理和病理过程。截至目前，激素水平和激素受体在腋臭发生发展中的作用研究还很少。而最近在前列腺癌的研究表明AR可以调节ApoD的表达[11]，提示AR信号可能参与了腋臭发病过程中ApoD的表达调控。

本研究发现，AR信号可以通过JNK1刺激ApoD的表达；但抑制JNK1并不能完全阻断AR信号对ApoD的表达上调；提示AR还可以通过JNK1非依赖的方式刺激ApoD的表达。此外，JNK1本身可以刺激AR的转录活性，提示JNK1 可能通过调控AR信号调节ApoD的表达。因此，可以设想AR信号和JNK1信号之间存在某种反馈。需要指出的是，JNK1的活化不仅受到激素的调控，体内多种刺激可以促进JNK1的活化，而腋臭患者中JNK1活化增强有无其它因素同样是值得探讨的重要科学问题。

综上，本部分实验我们发现：AR信号可以通过活化JNK1，促进ApoD的表达。进一步研究JNK1活化和ApoD表达在腋臭发生中的作用，对加深腋臭发病机制的认识和无创治疗腋臭具有重要的意义。

[参考文献]

[1]杨光荫，彭苏格.内蒙古伊克昭盟地区蒙古族、汉族人群腋臭发病率调查报告[J].人类学学报，1993，13：80-82.

[2]亓发芝.腋臭[J].实用美容整形外科杂志，2002，13（1）：55-56.

[3]Gallagher M，Wysocki CJ，Leyden JJ，et al.Analyses of volatile organic compounds from human skin[J]. Bri J Dermatol，2008，159（4）：780-791.

[4]Akutsu T，Sekiguchi K，Ohmori T，et al.Individual comparisons of the levels of （E）-3-methyl-2-hexenoic acid，an axillary odor-related compound，in Japanese[J].Chem Senses，2006，31（6）：557-563.

[5]Natsch A，Schmid J，Flachsmann F.Identi？cation of odoriferous sulfanylalkanols in human axilla secretions and their formation through cleavage of cysteine precursors by a C-S lyase isolated from axilla bacteria[J].Chem Biodivers，2004，1（7）：1058-1072.

[6]Spielman AI，Zeng XN，Leyden JJ，et al.Proteinaceous precursors of human axillary odor：isolation of two novel odor-binding proteins[J].Experientia，1995，51（1）：40-47.

[7]Kurata S，Itami S，Komada S，et al. Int ranuclear androgen and cytosolic receptor concent rations in the axillary skin of osmidrosis[J].Arch Dermatol Res，1990，282（1）：33-37.

[8]Beier K， Ginez I， Schaller H. Localization of steroid hormone receptors in the apocrine sweat glands of the human axilla[J].Histochemistry and Cell Biology，2005，123 （1）：61-65.

[9]Zeng XN， Leyden JJ， Brand JG，et al.An investigation of human apocrine gland secretion for axillary odor precursors[J].J Chem Ecol，1992，18（7）：1039-1055.

[10]鲁开化，澎湃，刘斌，等.腋臭外科治疗的临床与病理观察[J].中国美容医学，2008，17（10）：1421-1424.

[11]Ogawa S，Hosoi T，Shirake M，et al.Association of estrogen receptor beta gene polymorphism with bone mineral density[J].Biochem Biophys Res Commun，2000， 269（2）：537-541.

[收稿日期]2012-07-21[修回日期]2012-09-28

编辑/张惠娟