刘立荣
摘 要:本研究以陆英为研究对象,对具有抗肝炎活性的化学成分绿原酸进行了提取工艺、含量测定方法的研究。实验结果表明:绿原酸在0.8~40 μg/ml浓度范围内线性关系良好,相关系数为0.9998,平均回收率为96.1%,RSD值为4.5%。该方法准确性、重复性好,为评价陆英质量提供了一个定量依据。
关键词:陆英 提取工艺 质量评价 高效液相色谱法
中图分类号:R284 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2012)12(b)-0-01
该文建立了陆英药材中绿原酸的HPLC含量测定的方法,该方法简便、准确、重复性好,为全面评价陆英药材质量提供了定量依据。
1 药品、色谱条件及其优化、对照品溶液和供试品溶液的制备
1.1 药品
绿原酸对照品,中国药品生物制品检定所提供。
1.2 色谱条件
色谱柱:phenomenexC18反相色谱柱(250×4.6 mm,5 μm)。流动相:(A)乙腈-(B)0.8%甲酸水溶液梯度洗脱:0~12 min:
A7%升至11%,B 93%降至89%;
12~49 min:A11%升至25%B89%降至75%。检测波长:326 nm。流速:1.0 ml/min。柱温:35 ℃。进样量:20 μl。
1.3 色谱条件的优化
①流动相系统的考察:试验采用乙腈-水系统,由于目标成分为酸性物质,经试验测定,最终确定采用乙腈-0.8%甲酸水溶液系统进行梯度洗脱。②流速的影响:考察了流速为0.8、1.0、1.2 ml/min对分离效果的影响,结果表明流速为1.0 ml/min时分离效果最佳。③柱温的影响:考察了柱温为30、35 ℃对分离效果的影响,结果表明柱温为35 ℃时分离效果最佳。综上所述,最终确定以采用乙腈- 0.8%甲酸水溶液系统进行梯度洗脱,流速为1.0 ml/min,柱温为35 ℃。
1.4 对照品溶液的制备
分别取绿原酸的对照品适量,精密称定,置于10 ml容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,配制成浓度为
0.402 mg/ml的标准储备液I,备用。再精密量取储备液I 0.10 ml,置5 ml容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,配制成浓度为8.04 μg/ml的标准储备液Ⅱ。
1.5 供试品溶液的制备
取陆英药材粉末约1.0 lg,精密称定,至100 ml锥行瓶中,加100 ml85%甲醇溶液,超声提取1.0 h。抽滤,旋转蒸发至近干,用甲醇转移至10 ml容量瓶中,定容至刻度,摇匀,微孔滤膜(0.45 μm)过滤后取续滤液作为供试品溶液。
2 结果
2.1 标准曲线的绘制
依次分别精密称取绿原酸的储备液I 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml置于10 ml量瓶中;再分别精密称取储备液Ⅱ1.0 ml,至10 ml量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀,制成7个不同浓度的标准溶液。分别取上述溶液20 μL进样,在上述色谱条件下进行HPLC分析,以对照品峰面积A对浓度C(μg/ml)回归分析,得绿原酸的标准曲线,绿原酸的回归方程为:A=5.8×104C-28121(r=0.9998,n=7)。结果表明,绿原酸在0.8~40 μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.2 检测限(LOD)和定量限(LOQ)
检测限是信噪比为3时的被测物浓度,为能从背景信号中区分出被检测物的最低浓度。定量限是信噪比为10时的被测物浓度,是指在保证具有一定可靠性的前提下,能够测定出的样品中被测物的最低浓度。通过重复测量3次求的平均值,RSD平均值小于5%,绿原酸的检测限和定量限分别为1.28 ng/ml和3.84 ng/ml。
2.3 重复性试验
取陆英药材粉末5份,约1.0 g,精密称定1.005 g。进行HPLC分析,记录色谱图峰面积:412028、389181、390383、412370和419431,RSD=3.4%。
2.4 稳定性试验
取陆英药材粉末约1g,精密称定,按“供试品溶液的制备”的方法制备供试品溶液,避光保存,备用。分别在0,4,8,12,24,48 h测试一次,记录色谱峰面积分别为:381583、380548、377956、376437和374985,RSD为0.7%。结果表明所有分析物在常温下,48 h内保持稳定。
2.5 回收率试验
向含量已知的陆英样品中加入已知量(72.6 μg)的混合标准储备液,然后进行提取和HPLC测试,通过测得量和加入量的比值计算回收率 。提取回收率考察了3个不同浓度,即分别在标准曲线的高、中、低三个水平,每个试验重复三次,计算平均回收率。结果见表1。方法的平均回收率为96.1%(100±10%),且RSD=4.5%(小于5%),表明本实验建立的方法具有良好的准确度。
3 结语
该文考察了提取溶剂的浓度、提取溶剂用量、提取时间三个因素,对提取工艺进行了优化。
考察50%到90%的甲醇溶剂作为提取溶剂对提取效率的影响:称取药材粉末1.00 g,分别加入50%、70%、85%和90%的甲醇,超声提取相同时间,平行操作4次,所得峰面积分别为:271254、367806、414800和424131。结果表明随着甲醇浓度增加,提取效率增加,但同时被提出的脂溶性杂质也增多,干扰目标成分的测定,最终确定85%甲醇溶剂为提取溶剂。以85%甲醇溶剂为提取溶剂,考察溶剂量从50 ml到120 ml的提取效率。操作过程同上,所得50、100、120 ml的峰面积分别为364216、426583和429823。
可见,随着甲醇浓度增加,提取效率增加,但是100 ml和120 ml提取的量相差不多,所以最终确定以85%甲醇100 ml为提取溶剂。在确定提取溶剂量和浓度之后,试验考察了从30 min到90 min提取时间对提取效率的影响。操作过程同上,结果见表2。可见,60 min和90 min的提取效率相差不多,最终确定为60 min为提取
时间。
表1 陆英中被测物质的回收率(n=3)
加入量
(μg) 测得量
(μg) 回收率
(%)
40 113.5 101.3
40 114.0 102.0
40 114.8 103.1
80 146.4 91.5
80 148.8 94.8
80 147.9 93.6
120 187.6 93.1
120 188.1 93.8
120 186.5 91.6
表2 提取时间对提取效率的影响
时间
(min) 峰面积
绿原酸 咖啡酸 阿魏酸
30 267957 127833 163121
60 390383 186810 214337
90 389181 185721 217543
因此,综合上述试验结果,确定最佳提取方法为:称取药材粉末1.0 g,加入85%甲醇溶剂100 ml,超声提取1.0 h。综上所述,该方法准确性和重复性较好,为评价陆英中绿原酸的含量提供了一个定量依据。