HPLC法测定陆英中绿原酸的含量

刘立荣

摘 要：本研究以陆英为研究对象，对具有抗肝炎活性的化学成分绿原酸进行了提取工艺、含量测定方法的研究。实验结果表明：绿原酸在0.8～40 μg/ml浓度范围内线性关系良好，相关系数为0.9998，平均回收率为96.1%，RSD值为4.5%。该方法准确性、重复性好，为评价陆英质量提供了一个定量依据。

关键词：陆英 提取工艺 质量评价 高效液相色谱法

中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2012）12（b）-0-01

该文建立了陆英药材中绿原酸的HPLC含量测定的方法，该方法简便、准确、重复性好，为全面评价陆英药材质量提供了定量依据。

1 药品、色谱条件及其优化、对照品溶液和供试品溶液的制备

1.1 药品

绿原酸对照品，中国药品生物制品检定所提供。

1.2 色谱条件

色谱柱：phenomenexC18反相色谱柱（250×4.6 mm，5 μm）。流动相：（A）乙腈-（B）0.8%甲酸水溶液梯度洗脱：0～12 min：

A7%升至11%，B 93%降至89%；

12～49 min：A11%升至25%B89%降至75%。检测波长：326 nm。流速：1.0 ml/min。柱温：35 ℃。进样量：20 μl。

1.3 色谱条件的优化

①流动相系统的考察：试验采用乙腈-水系统，由于目标成分为酸性物质，经试验测定，最终确定采用乙腈-0.8%甲酸水溶液系统进行梯度洗脱。②流速的影响：考察了流速为0.8、1.0、1.2 ml/min对分离效果的影响，结果表明流速为1.0 ml/min时分离效果最佳。③柱温的影响：考察了柱温为30、35 ℃对分离效果的影响，结果表明柱温为35 ℃时分离效果最佳。综上所述，最终确定以采用乙腈- 0.8%甲酸水溶液系统进行梯度洗脱，流速为1.0 ml/min，柱温为35 ℃。

1.4 对照品溶液的制备

分别取绿原酸的对照品适量，精密称定，置于10 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为

0.402 mg/ml的标准储备液I，备用。再精密量取储备液I 0.10 ml，置5 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成浓度为8.04 μg/ml的标准储备液Ⅱ。

1.5 供试品溶液的制备

取陆英药材粉末约1.0 lg，精密称定，至100 ml锥行瓶中，加100 ml85%甲醇溶液，超声提取1.0 h。抽滤，旋转蒸发至近干，用甲醇转移至10 ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）过滤后取续滤液作为供试品溶液。

2 结果

2.1 标准曲线的绘制

依次分别精密称取绿原酸的储备液I 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml置于10 ml量瓶中；再分别精密称取储备液Ⅱ1.0 ml，至10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，制成7个不同浓度的标准溶液。分别取上述溶液20 μL进样，在上述色谱条件下进行HPLC分析，以对照品峰面积A对浓度C（μg/ml）回归分析，得绿原酸的标准曲线，绿原酸的回归方程为：A=5.8×104C-28121（r=0.9998，n=7）。结果表明，绿原酸在0.8～40 μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2 检测限（LOD）和定量限（LOQ）

检测限是信噪比为3时的被测物浓度，为能从背景信号中区分出被检测物的最低浓度。定量限是信噪比为10时的被测物浓度，是指在保证具有一定可靠性的前提下，能够测定出的样品中被测物的最低浓度。通过重复测量3次求的平均值，RSD平均值小于5%，绿原酸的检测限和定量限分别为1.28 ng/ml和3.84 ng/ml。

2.3 重复性试验

取陆英药材粉末5份，约1.0 g，精密称定1.005 g。进行HPLC分析，记录色谱图峰面积：412028、389181、390383、412370和419431，RSD=3.4%。

2.4 稳定性试验

取陆英药材粉末约1g，精密称定，按“供试品溶液的制备”的方法制备供试品溶液，避光保存，备用。分别在0，4，8，12，24，48 h测试一次，记录色谱峰面积分别为：381583、380548、377956、376437和374985，RSD为0.7%。结果表明所有分析物在常温下，48 h内保持稳定。

2.5 回收率试验

向含量已知的陆英样品中加入已知量（72.6 μg）的混合标准储备液，然后进行提取和HPLC测试，通过测得量和加入量的比值计算回收率 。提取回收率考察了3个不同浓度，即分别在标准曲线的高、中、低三个水平，每个试验重复三次，计算平均回收率。结果见表1。方法的平均回收率为96.1%（100±10%），且RSD=4.5%（小于5%），表明本实验建立的方法具有良好的准确度。

3 结语

该文考察了提取溶剂的浓度、提取溶剂用量、提取时间三个因素，对提取工艺进行了优化。

考察50%到90%的甲醇溶剂作为提取溶剂对提取效率的影响：称取药材粉末1.00 g，分别加入50%、70%、85%和90%的甲醇，超声提取相同时间，平行操作4次，所得峰面积分别为：271254、367806、414800和424131。结果表明随着甲醇浓度增加，提取效率增加，但同时被提出的脂溶性杂质也增多，干扰目标成分的测定，最终确定85%甲醇溶剂为提取溶剂。以85%甲醇溶剂为提取溶剂，考察溶剂量从50 ml到120 ml的提取效率。操作过程同上，所得50、100、120 ml的峰面积分别为364216、426583和429823。

可见，随着甲醇浓度增加，提取效率增加，但是100 ml和120 ml提取的量相差不多，所以最终确定以85%甲醇100 ml为提取溶剂。在确定提取溶剂量和浓度之后，试验考察了从30 min到90 min提取时间对提取效率的影响。操作过程同上，结果见表2。可见，60 min和90 min的提取效率相差不多，最终确定为60 min为提取

时间。

表1 陆英中被测物质的回收率（n=3）

加入量

（μg） 测得量

（μg） 回收率

（%）

40 113.5 101.3

40 114.0 102.0

40 114.8 103.1

80 146.4 91.5

80 148.8 94.8

80 147.9 93.6

120 187.6 93.1

120 188.1 93.8

120 186.5 91.6

表2 提取时间对提取效率的影响

时间

（min） 峰面积

绿原酸 咖啡酸 阿魏酸

30 267957 127833 163121

60 390383 186810 214337

90 389181 185721 217543

因此，综合上述试验结果，确定最佳提取方法为：称取药材粉末1.0 g，加入85%甲醇溶剂100 ml，超声提取1.0 h。综上所述，该方法准确性和重复性较好，为评价陆英中绿原酸的含量提供了一个定量依据。