用于Real-time PCR检测的牛肉组织DＮA提取方法探索

李璟,陈世界,陈洋

摘要：使用Ｃｈｅｌｅｘ－１００提取牛肉组织ＤＮＡ，并用紫外分光光度法检测所提取的ＤＮＡ浓度和纯度，结果表明所提取的ＤＮＡ Ａ２６０ ｎｍ / Ａ２８０ ｎｍ在１．６６２～１．８２６之间，纯度较高。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ扩增提取的ＤＮＡ模板，表现出较高的敏感性。该ＤＮＡ提取方法效率较高，操作简便，能够获得较高质量的ＤＮＡ，适合检疫部门的快速检测需要。

关键词：ＤＮＡ；提取；Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ；牛肉组织

中图分类号：Ｑ９５３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）05－1028-02

Ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ of Ｂｅｅｆ Ｔｉｓｓｕｅ's ＤＮＡ ｆｏｒ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ＬＩ Ｊｉｎｇ１，ＣＨＥＮ Ｓｈｉ-ｊｉｅ２，ＣＨＥＮ Ｙａｎｇ１

（１． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｎｇｄｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００５９，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｓｉｃｈｕａｎ Ｅｘｐｏｒｔ ａｎｄ Ｉｍｐｏｒｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ， Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００４１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃｈｅｌｅｘ－１００ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｂｅｅｆ ｔｉｓｓｕｅ． Ｔｈｅ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ Ａ２６０ ｎｍ / Ａ２８０ ｎｍ ｏｆ ＤＮＡ ｗａｓ １．６６２～１．８２６． Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ． Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ， ｒａｐｉｄ ａｎｄ ａｂｌｅ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ， ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｂｙ ｉｎｓｐｅｃｔ ａｎｄ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＤＮＡ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； rｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ； ｂｅｅｆ ｔｉｓｓｕｅ

肉类食品的安全直接关系到人类的健康，建立准确的动物源性成分检测方法非常重要［１，２］。实时定量ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）将荧光能量传递技术应用于常规ＰＣＲ中，具有高特异性和高灵敏性［３－５］。提取用于Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测的ＤＮＡ模板的方法很多，酚抽提法、异丙醇沉淀法以及甲酰胺裂解法是提取ＤＮＡ最为经典的方法，但不适用于仅有少量提取材料时［６］。另外，酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染，有损操作者的健康［７］。玻璃棒缠绕法用盐酸胍裂解细胞，这种方法简单快速，但对操作技术要求较高，盐析法用饱和氯化钠代替有机溶剂去除蛋白质，所获得的ＤＮＡ可以满足ＰＣＲ的要求，但产率相对较低［８］。用Ｃｈｅｌｅｘ－１００作为金属离子螯合剂提取ＤＮＡ，其原理是细胞在含有Ｃｈｅｌｅｘ－１００悬浊液中煮沸时，细胞膜破裂释放出ＤＮＡ，同时与二价金属离子螯合，可以避免ＤＮＡ在金属离子的催化作用下降解，从而获得纯度较高的ＤＮＡ［９，１０］。本实验采用该法提取牛肉组织ＤＮＡ，并将其应用于Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测，探索将该方法运用于动物检验检疫的可行性。

１材料与方法

１．１材料与仪器

４份新鲜牛肉均购自成都市农贸市场；溶液Ⅰ（含质量分数２０％的Ｃｈｅｌｅｘ－１００）；ＭＧＢ－Ｔａｑｍａｎ探针、细胞色素ｂ基因通用引物（引物１：５′－ＴＡＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＣＴＧ－３′，引物２：５′－ＣＣＴＣＣＴＡＧＴＴＴＧＴＴＡＧＧＧＡＴＴＧＡＴＣＧ－３′）订购自上海基康生物技术有限公司；实验仪器包括高速离心机、荧光定量ＰＣＲ仪、漩涡振荡器、核酸蛋白检测仪、均质仪等。

１．２实验方法

１．２．１牛肉组织ＤＮＡ的提取方法与步骤称取新鲜牛肉５０ ｍｇ，加入５００ μＬ生理盐水，漩涡振荡１０ ｍｉｎ充分混匀，直至沉淀泛白。１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，弃上清（若离心沉淀为红色，继续混匀后离心）。在沉淀中加入溶液Ⅰ ３００ μＬ，漩涡振荡１０ ｍｉｎ，重新悬浮沉淀。沸水浴处理１０ ｍｉｎ，１３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，取上清液待用，共提取４份牛肉组织样品的ＤＮＡ。

１．２．２ＤＮＡ的浓度及纯度测定用核酸蛋白检测仪在２６０ ｎｍ和２８０ ｎｍ波长下分别测定提取的ＤＮＡ样品吸光度，并计算Ａ２６０ ｎｍ / Ａ２８０ ｎｍ及ＤＮＡ浓度。

１．２．３Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测提取的ＤＮＡ本实验的ＰＣＲ程序以ＡＢＩ ＰＲＩＳM ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ为基础建立。Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ反应体系如下：２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２．５ μＬ，引物１和引物２各１．５ μＬ，探针１．５ μＬ，分别加入提取的ＤＮＡ模板０、１、２、３ μＬ，加蒸馏水至２５ μＬ。反应程序为：９５ ℃预变性１０ ｍｉｎ；９５ ℃变性４５ ｓ，５３ ℃退火６０ ｓ，７２ ℃延伸６０ ｓ，４０个循环［１１］。反应过程中通过与循环变温加热器相连的ＣＣＤ摄像检测荧光值，ＡＢＩ ＰＲＩＳM ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ软件分析ＤＮＡ扩增曲线。

２结果与分析

２．１提取的ＤＮＡ浓度和纯度检测结果

分光光度法检测结果表明，提取的４份牛肉组织ＤＮＡ的Ａ２６０ ｎｍ / Ａ２８０ ｎｍ均在１．６６２～１．８２６之间，质量较好（表１）。

２．２Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ扩增结果及检测

Ｃｔ值即阈值循环数，表示能被仪器明显检测到的荧光值（ΔＲｎ）到达设定的阈值时所对应的循环数，在扩增曲线上通常表现为进入快速扩增期时的循环数。每个模板的Ｃｔ值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ｃｔ值越小。以提取的ＤＮＡ为模板进行Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ，结果显示加入提取的牛肉组织ＤＮＡ样品体积分别为３、２、１ μＬ时，得到的ＰＣＲ扩增曲线Ｃｔ值递增。如图１中箭头所示，Ｃｔ值与ＤＮＡ模板量的相关性较好，ＤＮＡ模板量越大，Ｃｔ值越低。说明用此方法提取ＤＮＡ，在有效去除ＰＣＲ抑制剂的同时，没有降低Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ的敏感性，也避免了ＰＣＲ反应假阴性结果的出现。

３结论与讨论

本实验采用的Ｃｈｅｌｅｘ－１００是一种离子螯合剂，由苯乙烯和苯二乙烯组成，其悬浊液在碱性环境（ｐＨ １０～１１）和１００ ℃的条件下可导致细胞膜的破裂和ＤＮＡ的变性并释放出来［１２］。使用Ｃｈｅｌｅｘ－１００提取ＤＮＡ时，不用蛋白酶Ｋ消化，血红素从血红蛋白中的释放减少，可使获得的ＤＮＡ纯度提高。Ｃｈｅｌｅｘ－１００还可以结合金属离子，阻止金属离子对ＤＮＡ降解的催化作用。同时由于Ｃｈｅｌｅｘ－１００颗粒可离心去除，不会干扰ＰＣＲ扩增反应体系中的Ｍｇ２＋等离子浓度。此外，借助于ＰＣＲ反应体系中的缓冲液，其碱性也不会影响到ＰＣＲ的扩增反应。Ｃｈｅｌｅｘ－１００提取方法对组织的需求量很少，本实验中５０ ｍｇ牛肉组织中提取的ＤＮＡ可用于ＰＣＲ扩增的次数大于３００次（１ μＬ模板量）。本方法提取的ＤＮＡ适用于Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ扩增，省时快速，可用于动物组织的快速检测。

综上所述，Ｃｈｅｌｅｘ－１００快速提取牛肉组织ＤＮＡ的方法提取效率较高，实验操作简单，无需贵重仪器和有毒化学物质，能够获得较高质量的ＤＮＡ，且适用于Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测，可被应用于动物新鲜组织的ＤＮＡ提取。

参考文献：

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