消化道不同恶性肿瘤患者血清锌α-2-糖蛋白水平检测及临床意义

孟 倩 赵旭宏 赵 瑾 雷 婷 张 曼

(首都医科大学附属北京世纪坛医院临床检验中心，北京 100038)

Ryden M等［1］研究发现肿瘤患者脂肪丢失与脂肪降解增加密切相关，不良的脂质代谢状态可能会降低疾病的生存率，并且减低患者对抗肿瘤治疗的耐受性。因此本实验对一种脂质降解因子锌α-2-糖蛋白(zincα-2-glycoprotein，ZAG)在消化道不同恶性肿瘤患者血清中的表达进行了研究，希望它能够作为评价肿瘤患者脂代谢状态的有效指标。ZAG是一个相对分子质量约43 000的单链糖蛋白，它作为一种脂解因子可以促进脂肪细胞的脂质分解，从而在许多肿瘤组织特别是恶病质状态中呈高表达［2］，应用免疫组织化学的方法发现ZAG在某些正常分泌上皮细胞的细胞质中有表达，其中包括乳腺、前列腺、肝脏、以及唾液腺、支气管、胃肠道和汗腺上皮细胞。因此ZAG可以分泌进入多种体液中［3］。

本实验对消化道常见肿瘤包括胃癌、直肠癌、结肠癌、肝癌患者及正常和良性对照组患者血清中的ZAG的表达进行了初步的鉴定，并对他们血清中脂代谢相关指标进行了检测，旨在探讨这些肿瘤患者的脂质代谢状况与ZAG的关系。

1 材料和方法

1.1 临床标本采集及脂代谢指标检测

实验采集血清标本进行研究和分析，癌症患者组样本胃癌、直肠癌、结肠癌、肝癌各6例，良性对照组样本胃息肉、结肠息肉、直肠息肉、肝囊肿各6例，收集正常对照组样本6例。所有标本均来自首都医科大学附属北京世纪坛医院，所有患者均经过病理确诊。患者年龄均大于45岁，既往体健。表1详细列出了3组样本的数量，各样本的年龄性别及诊断。由首都医科大学附属北京世纪坛医院临床检验中心在2 h内对实验中采集的新鲜血清标本脂代谢相关指标进行了检测，具体应用总胆固醇测定试剂盒(MERIT CHOICE)，三酰甘油测定试剂盒(MERIT CHOICE)，高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒(SEKISUI)，低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒(SEKISUI)，对采集血清中的总胆固醇(total cholesterol，TC)，三酰甘油(triglyceride，TG)，高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDLC)，低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)进行了检测。

表1 患者信息列表Tab.1 Patients'information list(n=6)

1.2 蛋白免疫印迹分析

血清标本经过定量后各取60 μg(总蛋白)上样进行SDS-PAGE，电泳电压60/120V。然后进行半干转膜，将蛋白转到 PVDF膜上，12V恒压转膜100 min。之后用含5%脱脂奶粉的 PBST(含0.05%Tween的PBS)对膜进行封闭，时间2 h。最后用下列抗体进行蛋白免疫印迹分析:一抗为鼠源性抗ZAG单克隆抗体(Santa Cruz)，β-actin单克隆抗体(Abcam)，将抗体用封闭液分别以1∶100，1∶500稀释，将膜置于抗体稀释液中4度过夜。翌日PBST洗膜3次，每次20 min。之后进行二抗孵育，二抗为羊抗小鼠辣根过氧化酶抗体，抗体的稀释浓度为1∶300，室温下在摇床上孵育90 min后，PBST洗膜3次，每次15 min。之后应用DAB增强显色液对膜进行显色。应用Image J分析软件对条带吸光度进行鉴定。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0软件进行统计分析，实验数据用均数±标准差)表示，用方差分析对脂代谢相关指标TC、TG、HDL-C、LDL-C及 ZAG在胃病组(正常健康人，胃息肉，胃癌)、肝病组(正常健康人，肝囊肿，肝癌)、结肠疾病组(正常健康人，结肠息肉，结肠癌)、直肠疾病组(正常健康人，直肠息肉，直肠癌)中每组3个样本血清中的含量做统计学分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 脂代谢指标检测结果

由首都医科大学附属北京世纪坛医院临床检验中心对每种消化道恶性肿瘤及其相对应的良性组患者和正常健康人血清中的总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)进行了检测，具体检测结果见表2。在肝病组、胃病组、结肠疾病组、直肠疾病组中，恶性组患者血清中的TC，TG，HDL-C，LDL-C与正常人和良性组相比，差异无统计学意义(P均＞0.05)。

表2 正常组、良性组及癌症组患者脂代谢指标列表Tab.2 The index list for lipid metabolism(mmol/L)

2.2 患者血清中ZAG的检测结果

实验应用蛋白免疫印迹的方法对所有样本血清中ZAG的表达进行了鉴定(图1)。以β-actin作为内参对胃病组(正常健康人，胃息肉，胃癌)、肝病组(正常健康人，肝囊肿，肝癌)、结肠疾病组(正常健康人，结肠息肉，结肠癌)、直肠疾病组(正常健康人，直肠息肉，直肠癌)中每组ZAG表达的相对变化水平作了半定量分析，得到了ZAG在正常组和每种疾病组样本中倍比变化的相对比率(图2)。统计学分析显示在胃病组、结肠疾病组、直肠疾病组中，ZAG在恶性、良性和正常组3组间的表达差异无统计学意义(P=0.589，P=0.618，P=0.864)。而 ZAG在肝癌患者血清中的表达与正常健康人、良性组相比差异具有统计学意义(P=0.013，P=0.008)，但正常健康人与良性组患者比较，差异无统计学意义(P=0.804)。

图1 各样本中ZAG相对表达Fig.1 Detection the relative expression level of ZAG in all serum samples ZAG:zinc-α-glycoprotein.

图2 ZAG在各样本组中的相对表达Fig.2 Relative expression level of ZAG in sample groups ZAG:zinc-α-glycoprotein.

3 讨论

脂质代谢状态对肿瘤患者的生存率具有重要影响，ZAG作为一种脂质降解因子，它的表达增加与肿瘤患者恶病质的发生有关，因此对ZAG的检测具有重要意义，它可能成为评价肿瘤病人脂质代谢状态的一个有价值的指标。研究［4］显示ZAG在多种生物过程中发挥作用，例如脂质代谢、受精、抗原处理和提呈等，但它的功能尚未完全研究清楚。血清中的ZAG是肝脏产生分泌的，而精液中高含量的ZAG则来源于前列腺，脂肪细胞也能合成ZAG。除了血清和精液，在尿液、唾液、汗液、脑脊液等多种体液中都能够检测到这种蛋白［5］。目前关于ZAG在正常健康人和消化系统不同部位恶性肿瘤患者血清中的表达状态比较的研究未见报道。

本实验对消化系统恶性肿瘤包括胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌及相应良性病组患者和正常健康人的血清中的ZAG含量做了初步鉴定;并对收集的所有样本血清中的脂代谢相关指标 TC、TG、HDL-C、LDL-C进行了检测。结果显示在肝病组、胃病组、结肠疾病组，直肠疾病组患者血清中，TC、TG、HDL-C、LDL-C在正常健康人、良性病、恶性病组间差异无统计学意义。在胃病组、结肠疾病组，直肠疾病组中ZAG的含量在恶性肿瘤组、良性病变组与正常组中差异无统计学意义。而在肝病组中，肝癌患者血清中ZAG相对于正常健康人和肝囊肿表达增多，差异有统计学意义。所以我们推断与实验中检测的其他消化道恶性肿瘤相比，ZAG在肝癌中的表达更具有临床诊断意义。与CHOL、TG、HDL-C、LDL-C相比，它在评价肝癌患者脂代谢状态方面可能更加灵敏。

［1］Rydén M，Agustsson T，Andersson J，et al.Adipose zinc-α2-glycoprotein is a catabolic marker in cancer and noncancerous states［J］.J Intern Med，2012，274(4):414 －420.

［2］Bing C，Bao Y，Aenkins G，et al.Zinc-α2-glycoprotein，a lipid mobilizing factor，is expressed in adipocytes and is upregulated in mice with cancer cachexia［J］.PNAS February，2004，101(8):2500 －2505.

［3］Tada T，Ohkubo I，Niwa M，et al.Immunohistochemical localization of Zn a2-glycoprotein in normal human tissues［J］.J Histochem Cytochem，1991，39:1221 －1226.

［4］Hassan M I，Waheed A，Yadav S，et al.Zinc α2-glyco protein:a multidisciplinary protein［J］.Mol Cancer Res，2008，6(6):892－906.

［5］Tada T，Ohkubo L，Niwa M，et al.Immunohistochemical localization of Zn-alpha2-Glycoprotein in normal human tissues［J］.J Histochem Cytochem，1991，39(19):1221－1226.