酱油中对羟基苯甲酸酯类的测定

齐懿鸣，孙英丽

（1.黑龙江省农垦乳品检测中心，哈尔滨 150090；2.黑龙江完达山哈尔滨乳品有限公司，哈尔滨，150078）

对羟基苯甲酸酯( parabens) 又名尼泊金酯，是一类由对羟基苯甲酸所形成的酯，因其抗菌谱广，在空气中稳定、对酸碱稳定、低毒和价格低廉等诸多优点，被广泛用做食品、药品、化妆品等的防腐抗菌剂。对羟基苯甲酸酯虽然可以被人体快速吸收、代谢并排泄，但近年来有研究显示，该类物质和其代谢物具有弱雌激素活性，可能是乳房癌和男性不育等疾病的诱因[1]。对羟基苯甲酸酯最大允许使用量（以对羟基苯甲酸计），酱油、果酱（罐头除外）、酱及酱制品、果蔬汁（肉）饮料、风味饮料0.25g/kg、经表面处理的鲜水果、新鲜蔬菜0.012g/kg；焙烤食品馅料（仅限糕点馅）0.5g/kg；热凝固蛋制品（如蛋黄酪、松花蛋肠）、碳酸饮料0.2g/kg；醋0.1 g/kg。对羟基苯甲酸也用作染料、农药的中间体。在农药中用于合成有机磷杀虫剂GYAP、CYP；在染料工业中用于合成热敏染料的显色剂；还可用于彩色胶片及合成油溶性成色剂“538”及尼龙12中用作增塑剂的生产原料。另外，还用于液晶聚合物和塑料。

本文所采用的方法参考了GB/T 5009.31-2003[2]，对样品前处理和色谱分析方法进行优化改进，并用GB/T 5009.1-2003附录A计算检出限、精密度、回收率等。该法适用于检测醋、果汁、果酱及含乳饮料等食品中对羟基苯甲酸酯类的检测。

1 材料与方法

1.1 方法提要

试样酸化后，对羟基苯甲酸酯类用乙醚提取浓缩后，用氢火焰离子化检测器的气相色谱仪进行分离测定，外标法定量。

2.2 试剂

2.2.1 乙醚、重蒸。

2.2.2 无水硫酸钠。

2.2.3 饱和氯化钠溶液。

2.2.4 无水乙醇。

2.2.5 10g/L碳酸氢钠溶液。

2.2.6 1：1盐酸：量取50mL盐酸，用水稀释至100mL。

2.2.7 对羟基苯甲酸乙酯、丙酯标准溶液：准确称取对羟基苯甲酸乙酯、丙酯各0.1000g溶于100mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，该溶液1mg/mL。

2.2.8 对羟基苯甲酸乙酯、丙酯使用溶液：分别吸取0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL对羟基苯甲酸乙酯、丙酯标准溶液于10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，此时浓度分别为0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL。

2.3 仪器和设备

2.3.1 气相色谱仪：配有FID检测器。

2.3.2 旋转蒸发器。

2.4 测定步骤

2.4.1 提取净化

称取5g的酱油于125mL分液漏斗中。加入1：1盐酸酸化，10Mlbaohe 氯化钠溶液，摇匀，分别以75mL、50 mL、50 mL乙醚提取三次，每次2min，放置片刻，弃去水层，合并乙醚层于250mL分液漏斗中，加10mL饱和氯化钠溶液洗涤一次，再分别以10g/L碳酸氢钠溶液30mL、30mL、30mL、洗涤三次，弃去水层。将提取液经事先装有15—20g无水硫酸钠的漏斗滤入250mL 瓶底烧瓶中，用旋转蒸发器蒸干，然后转移定容至5mL容量瓶中，供气相色谱仪用。

2.4.2 测定

2.4.2.1 色谱条件

色谱柱：DB-1701毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 um）；

进样量：1 μL；

分流比：20：1

进样口温度：230 ℃；

载气：氮气，1 mL/min；

升温程序：100 ℃保持1 min，以10 ℃/min进行升温，达到250 ℃保持2 min；

检测器温度：250 ℃；

H2流速：45 mL/min；

Air流速：450 mL/min。

2.4.2.2 标准曲线

将对羟基苯甲酸乙酯、丙酯标准系列溶液分别进样后，以标样浓度对峰面积作标准曲线。线性相关系数为0.9990以上。

2.4.2.3 将试样进样，根据标准品的保留时间定性样品中对羟基苯甲酸乙酯、丙酯的色谱峰。根据样品的峰面积，查标准曲线得出对羟基苯甲酸乙酯、丙酯的含量。

2.5 结果计算

样品中对羟基苯甲酸酯类含量按式计算：

式中：X——样品中对羟基苯甲酸酯类的含量，单位为毫克每千克（g/kg）；

C——从标准曲线求得测定溶液中对羟基苯甲酸酯类的含量，单位为微克每毫升（mg/mL）；

V——试样的定容体积，单位为毫升（mL）；

m——试样质量，单位为克（g）。

所得结果保留两位小数。

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的10%。

5 检测方法评价

5.1 线性分析范围评价

将标准使用液按照色谱条件，注入气相色谱仪，以峰面积进行定量，绘制成曲线。见图1、图2。Y1= (-5542.225053) +(915976.434764) X；R2=0.999827；Y2= (-5898.232289) +(974952.472964)X；R2= 0.999898

图1 对羟基苯甲酸乙酯标准曲线

图2 对羟基苯甲酸丙酯标准曲线

表1 对羟基苯甲酸乙酯测定结果统计（空白样品测定含量为0g/kg）

表2 对羟基苯甲酸丙酯测定结果统计（空白样品测定含量为0g/kg）

从图1和图2中可以看出对羟基苯甲酸乙酯、丙酯的检测范围在0.05—0.80mg/mL范围内，线性良好，相关系数R=0.9998。

5.2 方法的准确度，精密度评价

用标准加入回收实验验证方法的准确度，用平行试验的精密度验证方法的重复性。按照方法要求来处理样品，所有样品均称取5g，在样品中分别添加0.4mg、0.6mg、0.8mg三个梯度的对羟基苯甲酸酯类混合溶液，同时测定空白样品，按照方法进行处理。按以上方法的色谱条件下进样，结果见表1、表2。

0.4 ppm标准溶液重复7次分析汇总报告：如表3、表4所示。

表3 对羟基苯甲酸乙酯精密度分析结果

表4 对羟基苯甲酸丙酯精密度分析结果

要求在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对值不得超过算术平均值的10%，所以此方法的精密度很高。

5.3 方法的检测底限评价

根据3倍信噪比所对应的浓度，计算得到对羟基苯甲酸乙酯的检出限为1mg/kg，对羟基苯甲酸丙酯的检出限为1mg/kg。

5.4 重现性

在本实验室内，通过人员比对实验来验证方法的重现性。实验员甲和乙用同一检测方法，同一检测仪器在不同时间，做一批样品，结果见表5、表6。

表5 实验员甲乙实验结果比对（对羟基苯甲酸乙酯）

表6 实验员甲乙实验结果比对（对羟基苯甲酸丙酯）

表3、表4结果表明：浓度在0.082g/kg时，实验员甲对羟基苯甲酸乙酯RSD%=2.21%、对羟基苯甲酸丙酯RSD%=1.71%，实验员乙对羟基苯甲酸乙酯RSD%=1.23%、对羟基苯甲酸丙酯RSD%=0.81%。对甲乙两人的检验结果，进行F检验和t检验，结果表明两人的对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯检验结果无显著差异。

6 结论

通过验证，对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯测定浓度在0.05—0.80mg/mL范围内线性良好，相关系数R=0.9998，检出限为1mg/kg，加标回收率在93.51%～95.94%之间，RSD%在所要求范围内，对双人比对实验结果进行F检验和t检验，结果表明其检验结果无显著差异。

从以上数据可以看出该方法检测酱油中对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯，结果准确可靠，可以适用于本实验室在实际工作运用此方法检测酱油中对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯的含量。

[1] 岳强.对羟基苯甲酸酯在人体中的暴露研究进展，北方环境，第23 卷第3 期2011 年3 月

[2] GB/T 5009.31－2003 食品中对羟基苯甲酸酯类的测定。