连翘苷对甲型流感病毒核蛋白基因表达的影响研究

段林建，张 清，王农荣，杨 斌，何士勤，孙 坚

甲型流感具有突然暴发、迅速扩散、季节性流行等特点，严重威胁全球人类健康。中草药为祖国传统医学的宝藏，用于治疗甲型流感越来越普遍。连翘 (Forsythia suspensa)为木犀科植物，味苦、无毒、性微寒，具有清热解毒、消肿散结之功效，常用于治疗风热感冒［1］。连翘为双黄连、银翘散等40余种药物的重要成分，具有明确的体外抗流感病毒作用［2］。本研究结合中医理论及现代分子生物学技术，通过甲型流感病毒核蛋白 (nucleoprotein，NP)基因的转染，观察连翘苷对NP基因转染后表达的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 真核质粒pcDNA3.1(+)/NP由本室制备;引物根据 (GenBank/NCB，GI:8486129)毒株的NP基因全长序列设计如下 NP－R1467:CGGGTTCGTTGCCTTTTCGTC、NP－1033:TGGATGGCATGCCACTCTGC;连翘苷 (南京泽朗医药科技有限公司，纯度98%);Hela细胞株由南昌大学医学院微生物教研室馈赠;DMEM基础培养基、Opti－MEM培养基 (USA，Gibco);胎牛血清 (USA，Hyclone);感受态细菌DH5α由本室制备及保存;质粒抽提纯化试剂盒 (USA，Genomed);甲型流感病毒NP(胶体金法)检测试剂盒 (北京，阿斯可来);LipofectamineTM2000、RNA抽提试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒、反转录聚合酶链反应 (RT－PCR)试剂盒(USA，invitrogen)等。

1.2 仪器 二氧化碳 (CO2)培养箱 (USA，Shellab);超低温冰箱 (JAPAN，SANYO);Ⅱ级生物安全柜 (北京，东联哈尔);洁净工作台 (上海，博讯);恒温恒湿振荡器 (太仓，华利达);电子天秤 (北京，赛多利斯);倒置显微镜 (JAPAN，Olympus);UV－2450紫外分光光度计 (日本，岛津);台式高速冷冻离心机 (湖南，凯达);移液器 (USA，Glison);聚合酶链式反应 (PCR)仪 (美国，伯乐)等。

1.3 实验方法

1.3.1 实验药物制备 电子天平微量称取连翘苷2 mg溶于10 μl浓度为100%的二甲基亚砜 (DMSO)中，加入9.99 ml无抗生素的生长液，配制的连翘苷原液浓度为200μg/ml，DMSO终浓度为1%，充分混匀后用φ0.22μm滤器过滤6次。

1.3.2 连翘苷实验浓度确定 在长满Hela细胞的培养瓶内加0.25%的胰蛋白酶2 ml，37℃消化约3 min，加等体积含10%胎牛血清的无抗生素DMEM培养液吹打，离心后计数，配制成密度为105个/ml的细胞悬液，1 ml/孔接种于24孔培养板，37℃、5%CO2孵箱培养24 h，吸出长成单层、密度均匀的培养孔内废液，加入PBS洗3次，将连翘苷原液用含1%胎牛血清的维持液进行2倍系列稀释，共设立10个稀释梯度，向每孔内加入不同浓度的药物，相同浓度设4个孔，同时设4个阴性细胞对照，37℃、5%CO2孵箱培养，每日观察各孔内细胞病变效应 (CPE)。与细胞对照组比，未出现明显细胞病变的浓度即为该药物的无毒最大界限浓度。将该浓度的下一个梯度稀释浓度设为实验用浓度。

1.3.3 质粒的培养、提取 将本室构建的NP重组质粒、空质粒与LB培养基按体积比5∶1 000，在恒温震摇床上37℃，200 r/min培养15 h，按Genomed质粒提取试剂盒说明书抽提NP重组质粒、空质粒，并用UV－2450紫外分光光度计测其浓度和纯度。

1.3.4 实验分组、转染及上清等检测 实验分为NP重组质粒组、连翘苷组、空质粒组、脂质体组、Hela细胞组，连翘苷组设5个复孔，余设3个复孔，重复实验4次。制备Hela细胞悬液，密度为2×105个/ml(不含抗生素的生长液)，以2 ml/孔接种于6孔板中，第2天长成单层、密度约100%，吸出废液，用Opti－MEM培养基洗2～3次，吸出废液。向各实验组加总体积为2 ml液体，连翘苷组、NP重组质粒组含4μg NP重组质粒与10μl LipofectamineTM2000组成的络合物;空质粒组含4μg空质粒与10μl LipofectamineTM2000组成的络合物;脂质体组内含10μl LipofectamineTM2000;Hela细胞组为生长液。37℃、5%CO2孵箱培养5 h，吸出废液。连翘苷组加入实验浓度连翘苷溶液2 ml，NP重组质粒组、空质粒组、脂质体组、Hela细胞组各加入2 ml不含抗生素的生长液，37℃、5%CO2孵箱培养48 h。吸出各孔内上清，用甲型流感病毒NP试剂盒 (胶体金法)检测。取连翘苷组2个复孔的细胞，分别用1 ml胰酶及1 ml生长液吹打消化，并用PBS洗2～3次，加入2 ml PBS配成细胞混悬液，放入－80℃冰箱反复冻融3次，使细胞裂解，裂解液用甲型流感病毒NP试剂盒(胶体金法)检测。该试剂盒检测试纸及胶体金上分别标记有抗甲型流感病毒NP、核心抗原单克隆抗体，可以检测＞5×104TCID50/0.1 ml。阳性:在检测区T和对照区C各出现一条红色条带;阴性:只在对照区C位置有一条红色带;若检测区T和对照区C均未出现条带，该检测试剂无效。

1.3.5 RNA的提取、第一链cDNA的合成 操作步骤见试剂盒说明书，合成后的cDNA稀释10倍作为RT－PCR模板备用。

1.3.6 RT－PCR校正曲线及连翘苷组、NP重组质粒组NP基因表达量 用25μl SYBRMIX，正、反向引物各1μl，2μl拷贝数为6.11×108/μl的质粒，10倍系列梯度稀释液为模板，21μl无核酶水，共50μl反应体系混合液，在PCR仪上以95℃，10 min;95℃，15 s;60℃，1 min;50℃，14 s;45个循环进行扩增，得出校正曲线。将模板分别换为2μl连翘苷组和NP重组质粒组的cDNA，按上述总反应体系和条件，进行PCR扩增，同一模板浓度做8个复孔，且每次均同步做校正曲线。按校正曲线公式计算连翘苷组、NP重组质粒组NP基因表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，计量资料以表示，组间比较采用t检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 连翘苷最大无毒浓度为25μg/ml，实验浓度为12.5μg/ml。

2.2 转染后48 h各组甲型流感病毒NP胶体金检测结果 NP重组质粒组在检测区T和对照区C各出现一条红色条带，且检测区红色条带颜色较深，说明该组甲型流感病毒NP含量高(见图1A)。空质粒组、脂质体组、Hela细胞组只在对照区C位置有一条红色带，说明基本不含甲型流感病毒NP(见图1B、C、D)。连翘苷组上清只在对照区C位置有一条红色带，检测区T基本无红色条带，说明该组无或可能含有微量NP(见图1E)。连翘苷组胞内对照区C位置有一条红色带，检测区T有一红色条带，但颜色较对照区弱，说明该组甲型流感病毒含量不高 (见图1F)。

2.3 实验组RT－PCR校正曲线 RT－PCR校正曲线相关性为0.998，效率为97.4%，该校正曲线可靠性高 (见图2)。

图2 实验组RT－PCR校正曲线Figure 2 RT－PCR calibration curve of experimental group

2.4 转染后48 h连翘苷组、NP重组质粒组NP基因表达量的比较 重复4次转染后48 h连翘苷组NP基因表达量为 (2.1±0.3) ×105拷贝数/μl，NP重组质粒组 NP基因表达量为(61.5±15.0) ×105拷贝数/μl，连翘苷组NP基因表达量低于NP重组质粒组，差异有统计学意义 (t=7.672，p＜0.05)。

3 讨论

甲型流感病毒NP由位于病毒RNA第5片段的NP基因编码，有型特异性、结构相对保守等特点，常被用于甲型流感的诊断与治疗。Miyoshi－Akiyama等［3］发现胶体金能迅速检测甲型流感病毒，且其检测带颜色的深浅不同和病毒的滴度相关，滴度越高颜色越深。Kao等［4］发现一种新的小分子化合物Nucleozin可以直接引起NP的聚集和抑制核积累。

中药连翘有苯乙醇苷类、木脂素类、五环三萜类、挥发油等多种成分，各成分作用不一，连翘苷为木脂素类单糖苷的主要成分，具有抗病毒、抑制血小板活化因子活性、抗氧化等作用。本实验将连翘苷的单体作用于甲型流感病毒NP基因转染后的HeLa细胞，发现HeLa细胞上清与细胞内NP表达的不同，与徐咏书等［5］研究板蓝根凝集素对NP表达现象有相似点，上清胶体金测试为阳性，细胞内为弱阳性，且本实验通过RT－PCR发现连翘苷可以使甲型流感病毒的NP基因拷贝数降低。本研究认为连翘苷可能通过抑制甲型流感病毒NP与病毒RNA结合形成NP复合物，阻碍NP基因复制，也有可能是抑制NP的转录水平或NP翻译后修饰的可能，解决这个问题有待于在今后工作中进一步研究。

1 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典 ［S］.北京:化学工业出版社，2010:159－160.

2 Su Wen，Xu Huifu，Huang Hao.Efects of the extract of Forsythia suspensa on influenza A H1N1 infection in vitro ［J］ .J Med Plant Res，2010，4(14):1455－1458.

3 Miyoshi－Akiyama T，Narahara K，Mori S，et al.Development of an immunochromatographic assay specifically detecting pandemic H1N1(2009)influenza virus［J］.Journal of Clinical Microbiology，2010，48(3):703－708.

4 Kao RY，Yang D，Lau LS，et al.Identification of influenza A nucleoprotein as an antiviral target［J］.Nature Biotechnology，2010，28(6):600－605.

5 徐咏书，孙坚，何士勤.三种板蓝根制剂对流感病毒核蛋白表达的影响［J］.山东医药，2010，50(27):8－10.