Livin和Caspase－3在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达及相关性研究

吴文新，刘惠民，崔爱荣，崔晋峰，张杰英，张祥宏

在大肠癌的“腺瘤－癌演进学说”中，细胞增殖与凋亡失衡是大肠癌发生的重要机制。Livin作为新发现的凋亡抑制蛋白，其异常高表达能抑制细胞凋亡，促进细胞异常增生并向恶性转化［1－2］。Caspase－3是细胞凋亡中的关键蛋白酶，它通过级联反应介导细胞凋亡。目前，关于Livin和Caspase－3在肿瘤中表达的研究国内外已有报道［3－4］，但Livin与Caspase－3在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的可能作用少有报道。本研究采用免疫组化法检测了118例散发性大肠管状腺瘤伴上皮不同程度异型增生及癌变组织中Livin和Caspase－3的表达情况，并研究两者的关系，以探讨Livin和Caspase－3在大肠管状腺瘤癌变中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院病理科2004年12月—2009年12月切除的散发性大肠管状腺瘤存档蜡块，由两位高年资病理医师对全部切片进行复诊。诊断为大肠管状腺瘤及癌变的组织118例，其中大肠管状腺瘤伴轻、中、重度异型增生及癌变病例分别为30、33、26和29例。同时选取25例正常大肠黏膜作对照。

1.2 免疫组化染色方法 采用免疫组化SP法对所有组织进行染色。实验按照说明书操作，兔抗人Livin多克隆抗体为Nanspec公司产品，稀释浓度为1∶150，兔抗人Caspase－3多克隆抗体为Santa Cruz公司产品，稀释浓度为1∶100，以磷酸盐缓冲液 (PBS)替代一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定 Livin和Caspase－3阳性表达主要定位于细胞质，染色结果根据染色强度和阳性细胞百分比进行综合计分。即随机选取5个高倍镜视野计数阳性细胞百分比的平均数，阳性细胞百分比＜5%、5% ～35%、36% ～70%和＞70%时分别计为0、1、2、3分;染色强度以多数阳性细胞呈现的染色计分，阳性细胞着色强度为无色、淡棕色、棕黄色和棕褐色时分别计为0、1、2、3分;将阳性细胞百分比和着色强度两者的计分相加，0～1分为阴性 (－)，≥2分为阳性 (+)。

1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计学软件，计数资料采用χ2检验，Spearman相关分析进行统计学处理，以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Livin表达情况 Livin阳性反应主要定位于细胞质，呈棕黄色。正常大肠黏膜组、大肠管状腺瘤伴异型增生组及癌变组的Livin阳性表达率分别为16.0% (4/25)、57.3% (51/89)和86.2%(25/29)，3组的Livin阳性表达率间差异有统计学意义 (χ2=27.027，p＜0.05，见图1、图2)。大肠管状腺瘤伴异型增生组和癌变组的Livin阳性表达率均明显高于正常大肠黏膜组 (χ2值分别13.335和26.617，p＜0.05)，癌变组的Livin阳性表达率亦高于大肠管状腺瘤伴异型增生组 (χ2=7.971，p＜0.05)。大肠管状腺瘤伴轻、中、重度异型增生组Livin阳性表达率分别为50.0%(15/30)、54.5%(18/33)和69.2%(18/26)，差异无统计学意义 (χ2=2.268，P＞0.05)。

2.2 Caspase－3表达情况 Caspase－3阳性反应定位于细胞质，呈棕黄色。正常大肠黏膜组、大肠管状腺瘤伴异型增生组及癌变组的Caspase－3阳性表达率分别为76.0% (19/25)、40.4%(36/89)和10.3% (3/29)，3组的Caspase－3阳性表达率间差异有统计学意义 (χ2=24.006，p＜0.05，见图3、图4)。大肠管状腺瘤伴异型增生组和癌变组的Caspase－3阳性表达率均明显低于正常大肠黏膜组 (χ2值分别为9.879和23.972，p＜0.05)，且Caspase－3在癌变组的表达明显低于在大肠管状腺瘤伴异型增生组的表达 (χ2=8.959，p＜0.05);大肠管状腺瘤伴轻、中、重度异型增生组Caspase－3阳性表达率分别为66.7% (20/30)、39.4% (13/33)和11.5% (3/26)，差异有统计学意义 (χ2=17.598，p＜0.05)。

2.3 Livin和Caspase－3表达的关系 Livin和Caspase－3的表达呈负相关 (r=－0.305，p＜0.05，见表1)。

表1 大肠管状腺瘤伴异型增生组及癌变组Livin和Caspase－3表达的关系Table 1 Correlation between the expression of Livin and Caspase－3 in colorectal tubular adenoma and with different dysplasia and with cancerous changes

图1 大肠管状腺瘤伴上皮异型增生，Livin在细胞质呈阳性表达(SP，×200)Figure 1 Positive expression of Livin in colorectal tubular adenoma with mild dysplasia

图2 大肠管状腺瘤癌变，Livin在细胞质呈强阳性表达(SP，×100)Figure 2 Strong positive expression of Livin in colorectal tubular adenoma with cancerous changes

图3 大肠管状腺瘤伴上皮异型增生，Caspase－3在细胞质呈阳性表达 (SP， ×100)Figure 3 Positive expression of Caspase－3 in colorectal tubular adenoma with dysplasia

图4 大肠管状腺瘤癌变，Caspase－3在细胞质呈阴性表达 (SP，×100)Figure 4 Negative expression of Caspase－3 in colorectal tubular adenoma with cancerous changes

3 讨论

大肠管状腺瘤被认为是大肠癌主要的癌前病变［5］，目前研究表明肿瘤的发生、发展与细胞凋亡基因及抑制细胞凋亡基因相互调控作用密切相关。

Livin是近年发现的凋亡抑制蛋白家族 (inhibitor of apoptosis protein，IAP)成员之一，因其特异性高表达于大多数肿瘤组织，与肿瘤的发生、发展相关，已成为当今研究的热点［6］。已有研究表明，Livin在大肠癌中表达增高并发挥其相应的作用［7］，但有关Livin在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达报道较少。本研究结果显示，Livin随异型增生程度的增高及癌变的出现，其阳性表达率逐渐增高，且明显高于正常大肠黏膜组，提示Livin表达上调可能是细胞逃离凋亡监视机制，造成异常的增殖，并使异常分化的细胞不断积累，由此推进病程进展，并向恶性转化，促使大肠管状腺瘤发生癌变，说明Livin的异常表达与大肠管状腺瘤癌变关系密切，可能参与了大肠管状腺瘤癌变的发生。

研究显示，Livin抑制细胞凋亡作用途径主要与Caspase家族相互作用，而Caspase－3是Caspase家族中重要的凋亡执行者［8］。Livin主要通过其 BIR区与半胱氨酸蛋白水解酶(Caspases家族)结合，抑制其活性，阻止Caspase－3蛋白在细胞凋亡时执行蛋白切除功能，达到阻断凋亡的作用。本研究结果显示，在大肠管状腺瘤癌变过程中，随异型增生程度的增高及癌变的出现，Caspase－3的表达呈递减趋势，说明Caspase－3能促进细胞正常死亡，抑制癌的发生，提示Caspase－3可能在大肠管状腺瘤癌变的发生、发展中起重要作用。此外，Livin与Caspase－3在大肠管状腺瘤癌变中表达呈负相关，Caspase－3蛋白在腺瘤癌变过程中被Livin抑制而表达降低，提示二者可能共同参与了大肠管状腺瘤癌变的发生过程，这证实Livin对诱发凋亡的效应性蛋白酶Caspase－3可能有直接抑制作用［8］。

总之，Livin不仅参与了细胞凋亡的调控，还促进了细胞增殖，Livin可能下调Caspase－3的表达，共同促进大肠管状腺瘤癌变的发生，Livin有望成为结直肠癌靶向治疗的一个新靶点。本课题组对大肠管状腺瘤癌变中细胞凋亡基因及抑制细胞凋亡基因间的相互调控作用有待进一步深入研究。

1 Salvesen CS，Duckett CS.IAP proteins:blocking the road to death's door［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2002，3(6):401 －410.

2 甄海宁，章翔.新的凋亡抑制因子Livin［J］.第四军医大学学报，2004，25(19):1822－1823.

3 薛书霞，张景华，李景武，等.Clusterin、Livin、Caspase-3蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达［J］.海南医学院学报，2011，17(12):1612－1617.

4 周卫东.Caspase－3和Survivin在膀胱移行细胞癌中的表达及其相关性［J］.中国全科医学，2009，12(7):1339.

5 郑杰.结直肠息肉和结直肠癌［J］.中华病理学杂志，2005，34(1):4－5.

6 Gzzaniga P，Gradilone A，Giuliani L，et al.Expression and prognostic significance of Livin，Survivin and other apoptosis related genes in the progression of superficial bladder cancer［J］.Ann Oncol，2003，14(1):85－90.

7 肖维，彭健，张阳德.联合检测外周血癌胚抗原mRNA及livin mRNA对早期发现大肠癌微转移肿瘤的意义研究［J］.中国全科医学，2011，14(6):2040.

8 Kasof GM，Gomes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］.JBiol Chem，2001，276(5):3238－3246.