金水六君煎对亚急性衰老模型小鼠氧化应激的影响

彭 圆,田代志,程 静,张丽君,王 平*

(1.湖北中医药大学基础医学院，湖北 武汉 430065；2.湖北中医药大学中药资源与中药复方省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430065)

真皮组织学改变是皮肤衰老最显著特征之一。皮肤衰老与氧化应激的关系已为许多研究所证实。氧化/抗氧化失衡是皮肤衰老的重要发生机制。氧化应激可直接损伤皮肤组织细胞,启动真皮纤维降解或变性,加剧皮肤老化进程[1]。本课题组在中医皮肤衰老理论指导下，采取D-半乳糖皮下注射建立亚急性衰老模型,观察补肾化痰方金水六君煎对衰老模型小鼠氧化应激的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 昆明种2月龄清洁级小鼠30只，体质量(20±2)g，雌雄各半,由华中科技大学同济医学院实验动物研究中心提供。动物质量合格证号：NO00004136，NO00004137。

1.2 主要药品与试剂 D-半乳糖(张家港市华昌药业有限公司)，临用前溶于超纯水,现配为10%浓度；金水六君煎各组分中药(熟地黄30 g，当归12 g，半夏12 g，陈皮10 g，茯苓12 g，炙甘草6 g等)购自湖北中医药大学国医堂药房。按原著换算，依照人单位体质量生药量求得小鼠单位体质量生药量，并扩大2倍，常法浓缩成0.70 g/mL(0.70 g生药/mL)的浸膏，避光冷藏备用。

羟脯氨酸试剂盒(Hyp)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器 AL104型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；721型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；FSH-Ⅱ型可调高速电动匀浆机(江苏省金坛市恒丰仪器厂)；TGL-16G-A型低温离心机(AnKe)；光学显微镜(重庆光学仪器厂)。

2 实验方法

2.1 亚急性衰老模型的制作及给药 根据性别和体质量随机分组，每组10只，雌雄分笼，共分3组，即空白组、模型组、金水六君煎组(以下简称金组)。适应饲养5 d后，参照文献[2]采用每天颈背部皮下注射10%D-半乳糖1 000 mg/kg造模，共6周。空白组每天颈背部皮下注射超纯水(0.10 mL/10 g)，模型组、空白组每天按0.20 mL/10 g体积灌胃给予超纯水，金组按浓度0.70 g/mL灌胃等体积的药物，连续6周。

2.2 生化指标测定 小鼠于第42天给药处理后，行两肩胛至两髂骨之间的备皮。次日行眼眶取血，于3 500 r/min离心5 min，取上层血清，参照试剂盒说明(下同)用于SOD活性与HYP含量的测定。

同时在冰上取背部皮肤组织块和肺组织制成10%匀浆，检测SOD活性。另取背部余皮0.1 g左右，检测皮肤组织HYP含量。

2.3 皮肤形态学观察 10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜(10×10)下观察。

3 实验结果

3.1 各组小鼠生化指标变化比较 见表1，表2。

表1 各组小鼠血清SOD、皮肤SOD、肺SOD活性比较±s,n=10)

表2 各组小鼠血清、皮肤羟脯氨酸含量比较±s,n=10)

3.2 皮肤形态学观察 空白组小鼠皮肤结构完整，表皮与真皮界线清晰，表皮规则，真皮层厚，纤维排列致密、数量多；皮下脂肪细胞稀少；毛囊、皮脂腺清晰可见。与空白组比较，模型组小鼠皮肤显著变薄，真皮纤维排列疏松、数量减少；皮下脂肪细胞填充明显增多，达5～7层。与模型组比较，金组小鼠皮肤显著增厚，真皮纤维排列密集、数量增多，皮下脂肪细胞填充明显减少，0～2层。

4 讨论

皮肤衰老的发生机制尚未完全明了,氧化/抗氧化失衡所引起的氧化应激损伤被认为是皮肤衰老主要发病机制之一。氧化应激是指由于氧化剂增多和(或)抗氧化剂减少导致的氧化/抗氧化失衡状态。正常情况下机体存在抗氧化物系统,使得体内自由基的产生与消除处于动态平衡，不会产生明显的氧化应激损伤。在抗氧化物系统中SOD具有较强的抗氧化作用,是体内催化超氧阴离子为过氧化氢的关键酶，其含量的高低反映了机体清除氧自由基的能力。羟脯氨酸(HYP)是胶原纤维和胶原蛋白中的一种主要而又相对恒定的非必需氨基酸,其含量的测定已成为检测机体胶原代谢的重要指标，也是衡量皮肤衰老的指标之一。

皮肤衰老属中医学“衰老”范畴，以本虚标实为主要特征，本虚在于脏腑功能虚衰，标实在于痰浊。一方面肾虚为主的脏腑功能失调可导致痰浊的产生，即因虚致实；另一方面，痰浊为患又可影响气血津液的化生和运行，致本虚更甚，即因实而致虚，两者互为因果，形成恶性循环。以补肾化痰治法遣方用药，延缓皮肤老化，能做到标本兼治。结合本课题组对化痰方药改善肺系疾病的研究[3]成果及国内学者[4-5]对金水六君煎的研究,本实验选用金水六君煎，观察其对衰老模型小鼠皮肤氧化应激的影响。

本实验显示，D-半乳糖连续6周皮下注射能建立亚急性衰老模型，模型鼠不仅出现血清抗氧化功能的下降，而且皮肤组织SOD活性、血清与皮肤组织HYP含量均明显下降、皮肤显著变薄，真皮纤维排列疏松、数量减少。提示存在严重的氧化应激损伤。这与Tian等[6]的研究一致。金水六君煎组与模型组比较有显著差异,提示金水六君煎能明显改善衰老模型小鼠氧化/抗氧化失衡状态。此外，应用金水六君煎组后能明显增强模型鼠肺SOD活性，从而说明减轻肺组织的氧化损伤，可能有助于增强模型鼠肺行水布津，实现濡养滋润皮毛，延缓皮肤的衰老。

综上所述，通过补肾化痰，补充阴液之本，使水能润金，肺之气阴不受其损，改善肺气的宣发肃降，肃洁贮痰之器，恢复肺脏的行水布津功能，有助于减轻衰老组织的氧化应激损伤，纠正氧化/抗氧化失衡状态,这可能是金水六君煎改善衰老模型小鼠皮肤老化的机制之一。

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