天花粉降糖作用有效部位的研究

李 琼，叶小利，陈 新，黄 静，李学刚*,3

(1.西南大学药学院，重庆 400715；2.西南大学生命科学学院，重庆 400715；3.重庆市药效学评价工程中心，重庆 400715)

天花粉为葫芦科植物栝楼TrichosantheskirilowiiMaxim.或双边栝楼TrichosanthesrosthorniiHerms的干燥根，又名栝楼根，花粉、栝蒌粉，蒌粉等。其用药最早见于《神农本草经》,主治热病口渴、消渴(糖尿病)、黄疸、肺燥咳血、痈肿、痔痿[1]。现代药理研究[2]发现,天花粉具有致流产、抗早孕、抗癌、抗菌、抗病毒等作用。关于糖尿病的治疗作用并不多，根据目前文献报道，天花粉提取物及复方对于改善糖尿病及其并发证的各种症状具有明显效果[3-4]，而发挥降糖作用的有效部位及有效成分尚未见报道。本文采用人肝癌细胞HepG2和糖尿病小鼠模型,对天花粉醇提物和水提物降糖作用进行研究，为进一步的开发天花粉药理作用提供实验依据。

1 材料

1.1 药材和试剂 天花粉购于重庆市康源大药房，经西南大学药学院李学刚教授鉴定为葫芦科植物栝楼的干燥根，盐酸二甲双胍片为湖北午时药业股份有限公司产品(批准文号H20052404)；RM1640培养基购自Gibico公司，HepG2细胞购自北京军工所，胎牛血清购自Gibico公司，胰酶购自Sigma公司；葡萄糖试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号20100819)，SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号为20100919)，MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号为20101201)，2,7-Dichloro-dihydrofluoresce-diacetateDCFH-DA购自Sigma公司；四氧嘧啶购自Sigma公司，化学试剂均为分析醇。

1.2 动物 SPF级KM雄性小鼠，体质量(20±2)g，购自重庆医科大学实验动物中心,动物许可证号：SCXK(渝)20070001。饲养在室温(23±2) ℃，相对湿度40%～60%条件下，自由进食饮水，实验前稳定3 d。

糖尿病小鼠模型：平衡喂养3 d，禁食不禁水，12 h 后，尾静脉注射四氧嘧啶65 mg/kg，72 h后取血测定小鼠血糖，血糖值>11 mmol/L的小鼠为糖尿病模型小鼠。

1.3 仪器 酶标仪(BioTek)，二氧化碳培养箱(Thermo)，全自动生化分析仪(EOS bravo Plus)，紫外分光光度计(UV1800)，真空冷冻干燥机(北京长流科学仪器公司)。

2 方法

2.1 天花粉提取物的制备 天花粉粉碎，准确称取4 000 g，用5倍量85%乙醇超声提取2 h，过滤，提取3次，滤液合并浓缩得85%乙醇提取物。提取物用水混悬后，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得石油醚提取物(组分Ⅰ)、乙酸乙酯提取物(组分Ⅱ)，正丁醇提取物(组分Ⅲ)。

准确称取天花粉1 000 g，加1 000 mL的PBS缓冲液(pH 7.2)于4 ℃冰箱中搅拌浸提24 h，用纱布过滤，滤渣弃掉，得滤液总体积1 050 mL，于4 ℃条件下10 000 r/min离心20 min。弃去沉淀，收集上清液，冻干，得蛋白提取物(组分Ⅳ)。

2.2 天花粉提取物促进HepG2细胞葡萄糖吸收[5]HepG2细胞复苏后用含10%灭火的小牛血清的RM1640培养基转入100 mL培养瓶中，在37 ℃，5%CO2条件下培养。当细胞贴壁长满后，倾去培养基，用0.25%胰蛋白酶消化，每3 d按1∶3比例传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。

将HepG2细胞用含10%小牛血清的RM1640培养基转入48孔板中,每孔加300 μL。待细胞长至80%～90%融合后，把48孔板中的培养基更换无血清的培养基,每孔225 μL。将细胞分为空白组，二甲双胍组，药物组(组分Ⅰ，组分Ⅱ，组分Ⅲ，组分Ⅳ)，各给药组根据预试验结果分别在半数抑制浓度可能的浓度范围附近设置3个给药浓度，分别为100 mg/L、10 mg/L和1 mg/L，每个药物每个剂量设置3个平行，每孔25 μL。PBS缓冲液为空白对照。培养24 h后，每孔取出115 μL培养液于全自动生化分析仪的样品杯中，待检测。

促进葡萄糖吸收率(%)=(原培养基中葡萄糖量-药物组培养基中剩余葡萄糖量)×100%/(原培养基中葡萄糖量-空白对照培养基中葡萄糖量)

2.3 天花粉各组分对糖尿病小鼠血糖的影响[5-6]取糖尿病小鼠，随机分为6组，每组10只。组分Ⅰ(100 mg/kg)、组分Ⅱ(100 mg/kg)、组分Ⅲ(100 mg/kg)和组分Ⅳ(100 mg/kg)，高糖对照组灌胃蒸馏水，阳性对照组灌胃二甲双胍片(100 mg/kg)。连续灌胃15 d，每日1次。第16天，禁食不禁水12 h后，尾静脉取血测定空腹血糖。

3 结果

3.1 天花粉提取物的制备结果 见表1。

表1 天花粉各组分的提取结果

天花粉用85%乙醇超声提取后，所得总浸膏222 g。由表1可以看出，天花粉醇提物经萃取后有一半的组分仍留在水相中，相比之下，正丁醇部位(组分Ⅲ)收率最高，其次是石油醚部位(组分Ⅰ)，最低的是乙酸乙酯部位(组分Ⅱ)；天花粉用PBS缓冲溶液提取所得的蛋白提取物收率为0.64%。

3.2 天花粉各组分对HepG2细胞消耗葡萄糖的影响 见表2。

表2 天花粉各组分对HepG2细胞消耗葡萄糖的影响±s，n=3) mmol/L

表2结果所示,天花粉水提Ⅳ组分具有明显促进肝癌细胞吸收葡萄糖的作用，在相同给药剂量5 mg/L时，接近于二甲双胍；在相同浓度下，组分Ⅳ促进细胞消耗葡萄糖能力最强，石油醚、乙酸乙酯部位次之，正丁醇部位最弱。

3.3 天花粉各组分对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响 见表3。

表3 天花粉各组分对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影响±s，n=10) mmol/L

表3结果所示，组分Ⅳ的降糖作用最强，结果与细胞实验的结果类似。故组分Ⅳ是天花粉的有效降糖部位。

4 讨论

细胞降糖实验和动物实验的结果均表明，天花粉水提部位的降糖效果最好，石油醚、乙酸乙酯部位次之，正丁醇部位最弱。与有关文献[5]报道类似。糖尿病日久,会出现阴损及阳，阴阳俱虚或久病入络，血脉瘀滞，影响气血的正常运行，且阴虚内热，耗伤津液亦使血行不畅，而至血脉瘀滞，引发各种并发证[7-8]。随着人们生活水平的提高，糖尿病人群不断增加，天花粉具有确切的降糖作用。本实验利用肝癌细胞消耗葡萄糖模型和四氧嘧啶糖尿病小鼠模型结合提取分离手段，最终找出天花粉中降血糖的活性部位为天花粉凝集素蛋白部分。今后应对该部位进行成分研究，以促进天花粉的开发利用。

[1]中华人民共和国药典委员会.中国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010:52-53.

[2]李时珍.本草纲目[M].北京:人民卫生出版社,1957:1018.

[3]南国柱,裴元静,蒋国彦,等.栝楼根(天花粉)降血糖作用研究[J].药学学报,1959,7(1):43-44.

[4]仇伟欣.天花粉药理学研究进展[J].中国中医药信息杂志,1996,3(6):11-13.

[5]朱家颖,岑晓凤,陈星,等.黄连生物碱降糖活性协同作用研究[J].时珍国医国药,2010,21(9):2282-2284.

[6]吴建霞,郭利平,王婕.中药及其有效成分降糖作用机制的研究进展[J].吉林中医药,2010,30(2):181-182.

[7]苏秀海,孙文亮,李宝芬,等.复荣通脉胶囊治疗糖尿病周围血管病变76例临床研究[J].河北中医,2006,28(1):13-15.