卷柏总黄酮提取工艺研究

李庆杰,王怀生,王莲萍,赵昱玮,张莲珠,赵全成

(1.长春中医药大学附属医院,吉林 长春 130021；2.吉林天药药物研发有限公司,吉林 长春 130012；3.吉林省中医药科学院,吉林 长春 130021)

卷柏为卷柏科植物卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏Selaginellapulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.的干燥全草，味辛性平，具有活血通经功效，主要用于经闭、痛经，跌扑损伤等[1]。卷柏资源丰富,民间称为“九死还魂草、长生不老草、万年青”等，其中含有丰富的双黄酮，是该属植物的特征性成分，主要包括穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮、新柳杉双黄酮等化合物。双黄酮属天然多酚类抗氧化剂，具有抗脂质过氧化和清除自由基的作用，现代药理研究[2-4]表明，卷柏具有抗炎、抗病毒、镇痛、降血糖、抗痛风、增强人体免疫功能、抗衰老、抗肿瘤等作用，药材中的黄酮是发挥药效的主要成分。本实验采用正交设计法，以总黄酮和穗花杉双黄酮提取率为考察指标，对卷柏总黄酮的提取工艺进行了研究。

1 仪器与试药

LC-2010高效液相色谱仪(日本岛津)，SPD 10A型紫外检测器(日本岛津)，UV-1701紫外分光光度计(日本岛津)，分析天平(北京赛多利斯BSA224S)，超声波清洗器(北京天鹏TP-300)，恒温水浴。卷柏药材购自吉林省宏检医药药材公司，经鉴定为卷柏科植物卷柏 Selaginella tamariscina (Beauv.)Spring；穗花杉双黄酮对照品(自制，高效液相色谱面积归一化法测定，纯度为99.64%)；水为娃哈哈纯净水，甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交实验设计 选用正交表L9(34),分别以总黄酮和穗花杉双黄酮提取率作为考察指标，对卷柏总黄酮提取过程中影响较大的乙醇浓度(A)、提取次数(B)、乙醇倍数(C)提取时间(D)4个因素进行考察，每个因素3个水平，见表1。

表1 因素水平表

2.2 提取方法 称取药材9分,每分50 g，按L9(34)正交表实验，不同浓度乙醇回流提取，提取液滤过合并，减压回收乙醇浓缩成稠膏状，乙醇溶解并定容至250 mL容量瓶，作为储备液。

2.3 紫外分光光度法测定样品中卷柏总黄酮

2.3.1 供试品溶液制备 精密吸取1.25 mL储备液至50 mL容量瓶中加甲醇至刻度，摇匀，吸取稀释液2.5 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 标准曲线绘制 取穗花杉双黄酮对照品，精密称定，加甲醇制成0.52 mg/mL的对照品溶液，精密吸取1.0 mL置10 mL容量瓶中加甲醇定容至刻度，得浓度为0.052 mg/mL的对照品溶液，分别精密吸取0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0 mL置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀,在330 nm处测定吸光度。以吸光度和质量浓度进行线性回归，得回归方程Y=62.184X+0.024 2，r=0.999 3。

2.4 高效液相色谱法测定样品中穗花杉双黄酮

2.4.1 色谱条件 色谱柱为Agela C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.3%乙酸水(40∶60)，流速1.0 mL/min，检测波长330 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

2.4.2 供试品溶液的制备 取正交实验样品储备液1.25 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4.3 标准曲线绘制 分别吸取浓度为0.52 mg/mL对照品溶液各0.25,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，吸取10 μL，分别注入液相色谱仪测定，以峰面积为纵坐标(Y)，穗花杉双黄酮进样量为横坐标(X)，绘制标准曲线，计算得回归方程：Y=4 000 000X-16 844，r=0.999 7。结果表明，在0.13～1.3 μg范围内，穗花杉双黄酮进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 正交实验结果 以总黄酮和穗花杉双黄酮为指标考察结果相一致，即因素B为主要影响因素，因素A为次要影响因素，因素C、D的不同水平对结果影响不大,综合实验结果及实际生产中节约成本的需要，暂定工艺为A3B3C1D1。

2.6 验证实验结果 按照最佳工艺A3B3C1D1因素水平，进行3次验证实验，在此基础上，又追加2个条件进行实验：A3B4C1D1，增加提取次数，即加8倍量80%乙醇提取4次，每次1 h。A4B3C1D1，提高乙醇浓度，即加8倍量95%乙醇提取3次，每次1 h。结果优选工艺中总黄酮提取率为96.7%、穗花杉双黄酮提取率为93.8%,与正交实验中出现的最佳工艺相当，表明该工艺比较稳定；在优选工艺基础上增加提取次数、提高乙醇浓度，均未能显著增加卷柏总黄酮、穗花杉双黄酮提取率，综合上述实验结果，确定A3B3C1D1为最佳工艺条件，即每次8倍量80%乙醇，提取3次,提取时间为1 h。

3 讨论

根据文献[5-7]报道，卷柏总黄酮中含有穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮、新柳杉双黄酮等多种双黄酮成分，其中约80%左右为穗花杉双黄酮，故总黄酮的含量测定选择穗花杉双黄酮作为对照品，以保证实验结果更准确客观。

本实验采用紫外分光光度法测定总黄酮与高效液相色谱法测定穗花杉双黄酮相结合，增加了因素选择的准确性和可靠性，为下一步卷柏总黄酮的分离纯化打下良好基础。

[1]中华人民共和国药典委员会.中国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社,2010.

[2]毕跃峰,郑晓珂,冯卫生,等.卷柏属植物化学成分与药理活性[J].国外医药(植物药分册),2002,17(3):97-100.

[3]郑晓珂,毕跃峰,冯卫生,等.卷柏中化学成分[J].药学学报,2004,39(4):266-268.

[4]朱田密,陈科力,黎莉,等.垫状卷柏中双黄酮抑制黄嗓吟氧化酶的活性研究[J].中药药理与临床,2007,23(4):33-34.

[5]张莲珠,王伟琦,吕雪峰,等.正交设计优选神香苏合滴丸处方及成型工艺[J].长春中医药大学学报,2008,24(4):370-371.

[6]于秀华,王明星,付春,等.正交试验法优选痛风安胶囊提取工艺[J].长春中医药大学学报,2007,23(2):32.

[7]吕丽娟,马明辉,贡济宇,等.正交试验法优选麦冬多糖提取工艺[J].长春中医药大学学报,2007,23(2):30.