丹参注射液对细胞基底样乳腺癌MDA-MB-231细胞的影响

周瑞芳，刘鹏熙，刘晓雁

(广州中医药大学附属二院，广东省中医院，广东 广州 510405)

细胞基底样乳腺癌(basal-like)生物学特性具有侵袭性，容易发生转移，预后较差,不适合使用内分泌治疗,也无其他有效治疗手段，是目前治疗的难点之一[1]。因此，中医药干预在该亚型乳腺癌的综合治疗中就显得尤为重要。本研究应用中药丹参注射液进行研究，观察其对basal-like型的人乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的影响，期望能为basal-like型乳腺癌的治疗提供新的契入点。

1 材料与方法

1.1 材料 basal-like型乳腺癌细胞株MDA-MB-231(购自中国科学院上海生科院细胞资源中心)；小牛血清，RPMI1640培养基(美国Gibco公司)；0.25%胰蛋白酶，磷酸盐缓冲液(PBS，广州展晨生物科技有限公司)；青霉素、链霉素(广州天心制药厂)；噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)；丹参注射液(批号:061123)江西桔都药业有限公司。

1.2 细胞培养 人乳腺癌MDA-MB-231细胞采用开放式单层贴壁培养，培养液RPMI1640(10%小牛血清，青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL)，生长条件：37 ℃,5%CO2，相对饱和湿度。每天观察生长情况，贴壁2～5 d传代1次。实验时取对数生长期细胞。

1.3 实验分组 细胞对照组:不加任何处理因素，各处理组各浓度水平的共同对照。5个剂量丹参注射液组：2×10-1g/mL、2×10-2g/mL、2×10-3g/mL、2×10-4g/mL、2×10-5g/mL的丹参注射液。

1.4 观察指标

1.4.1 细胞存活率观察 MTT法测细胞增殖，收集对数生长期MDA-MB-231细胞，调整细胞悬液浓度为2×104/mL 接种于96孔板，培养箱内培养24 h,分别加入不同浓度梯度的丹参注射液继续培养，之后每隔24 h，每孔加入MTT(5 mg/mL)溶液20 μL,继续孵育4 h 终止培养，弃去孔内培养上清液，每孔加入DMSO 200 μL，使结晶物充分溶解。MTT比色法测定各孔光密度值，记录结果。用下列公式计算药物对细胞生长的抑制率:抑制率%=(对照孔测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值)/对照孔测定的平均OD值。

1.4.2 流式细胞仪检测凋亡率和细胞周期 各剂量组丹参注射液对MDA-MB-231细胞处理48 h，收集1×106个细胞，预冷的PBS液洗涤，1 300 rpm/min离心5 min,弃上清液，加入70%冷乙醇4 ℃固定并过夜，取固定好的细胞用4 ℃PBS洗2次,用500 μL/孔的碘化丙啶(PI)4 ℃避光染色30 min，上机前将细胞悬液混匀，过200目尼龙网，然后进行检测,应用CellQuest软件获取细胞10 000个，以ModiFit软件进行凋亡峰拟合及细胞周期分析并绘制DNA分布图，G1期前的G1亚峰(Ap峰)即为凋亡峰，同时计算出凋亡率。

2 结果

2.1 MTT法检测增殖 对于basal-like型乳腺癌MDA-MB-231细胞，丹参注射液作用24 h，1×10-1g/mL的高浓度组促进MDA-MB-231细胞增殖(P<0.01)，促增殖率为27.2%；1×10-5g/mL低浓度组抑制MDA-MB-231细胞的增殖(P<0.01)，抑制率为16.3%；在1×10-2g/mL、1×10-3g/mL、1×10-4g/mL浓度时对MDA-MB-231细胞增殖无影响。48 h，各剂量丹参注射液对MDA-MB-231细胞增殖均有抑制作用，抑制率分别为38.2%、29.9%、18.2%、15.6%、11.1%，差异均有统计学意义(P<0.05)。72 h，各剂量丹参注射液作用后其OD值均大于细胞对照组，促增殖率分别为46.%、37.6%、23.6%、45.6%、25.9%，差异均有统计学意义(P<0.05)。提示丹参注射液作用72 h能促进MDA-MB-231细胞增殖，见表1。

2.2 流式细胞仪检测凋亡 丹参注射液作用于MDA-MB-231细胞48 h后,1×10-1g/mL、1×10-2g/mL、1×10-5g/mL的浓度下MDA-MB-231细胞出现典型的凋亡细胞群，凋亡率分别为20.5%、16.6%、12.2%，见表2。

表1 丹参注射液作用于MDA-MB-231细胞24、48、72 h的OD值(±s)

表2 丹参注射液作用于MDA-MB-231细胞48 h的凋亡率及细胞周期

2.3 流式细胞仪分析细胞周期 丹参注射液作用于basal-like型乳腺癌MDA-MB-231细胞48 h，1×10-3g/mL、1×10-4g/mL的浓度下MDA-MB-231细胞G2/M期DNA含量明显增多，后者与对照组相比差异有统计学意义(χ2=7.6，P=0.022)。

3 讨论

Basal-like型乳腺癌的免疫组化特征为ER、PR和HER-2阴性,常表达基底上皮指标，并且侵袭性较强[2],这类患者易发生转移，预后较差，除放化疗并无其他特效的治疗方法，因此寻找新的有效的治疗方法尤其重要。丹参为唇形科多年生草本植物丹参的根及根茎，为活血化瘀类代表药，脂溶性成分丹参酮、丹参醌药理作用与植物性雌激素相似[3],研究中发现丹参有明确的促雌激素样作用。丹参注射液是中药丹参的静脉制剂，主要含多种丹参酮，水溶性酚酸类成分,如丹参素、迷迭香酸、丹酚酸B等是主要药效物质基础。本实验观察了丹参注射液对basal-like型人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响。

丹参注射液作用于人乳腺癌MDA-MB-231细胞24 h，其作用随着药物剂量的下降，由促进增殖过渡为对增殖无影响再到抑制增殖，48 h、72 h分别表现出抑制增殖和促进增殖的相反作用。并且在实验中1×10-3g/mL、1×10-4g/mL剂量组MDA-MB-231细胞G2/M期DNA含量明显增多。人乳腺癌MDA-MB-231细胞ER(-)，ER受体亚型ERɑ无表达，ERβ表达。PE通常在体内E2水平较低时表现出类雌激素效应。Wu Fei[4]发现外源性雌激素与E2的作用方式不同,他们的雌激素活性不需要激活ERɑ的AF-2区，对MDA-MB-231细胞的雌激素活性是结构依赖性的。因此我们认为丹参注射液促进MDA-MB-231细胞增殖、有丝分裂的作用与药物剂量相关，有时间依赖性，并且其作用方式可能是独立于ER的其他途径。敬静等[5]研究发现丹参酮Ⅱ对AMDA-MB-231细胞的增殖有明显的抑制作用，且呈时间一剂量一效应关系。翁时秋等[6]研究发现丹参酮作用于人乳腺癌MDA-MB-231细胞72 h后，GEP100基因表达峰度显著下调，在浓度达到1.0 μg/mL时下调尤为明显，认为丹参酮对于抑制乳腺癌转移有一定作用。张欣等[7]在体实验结果提示丹参酮ⅡA能够抑制接种MDA-MB-231细胞乳腺癌裸鼠肿瘤细胞的生长。以上研究与我们的实验结果存在较大差异，究其原因，本实验中使用丹参注射液，药物原成分保存相对完整，成分多样而复杂，需进一步的研究明了其各成分的真正效应及作用途径。

Chrzan BG[8]发现植物雌激素通过雌激素敏感元素报告基因激活ERβ1的转录，但他们的效应较17-βE2弱400-600倍,对受体ERβ1的选择性强于ERɑ。雌激素的转录效应受ERɑ和ERβ两种受体共同调节,但ERɑ促进增殖，ERβ抑制增殖[9]，且PE对ERβ有着更高的亲和力[10]。本实验中，丹参注射液抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，部分可能是通过ERβ发挥作用的。

细胞凋亡是指细胞在一定生理和病理条件下，遵循自身程序，由基因调控的主动性死亡过程。本实验中，1×10-1g/mL、1×10-2g/mL、1×10-5g/mL的浓度丹参注射液作用后，Basal-like型乳腺癌MDA-MB-231细胞P53基因变异,P53基因与细胞凋亡有密切关系。刘永惠等[11]研究发现丹参酮作用于接种MDA-MB-231S细胞的裸鼠后，经蛋白酶联免疫法检测发现丹参酮能有效的抑制突变型P53和mdm2的表达。本实验中丹参诱导了MDA-MB-231细胞的凋亡，可能是P53基因调节的。因此,我们认为，丹参注射液对Basal-like型乳腺癌MDA-MB-231细胞生长的影响与时间点、药物剂量相关。研究中某些剂量丹参注射液表现出促进MDA-MB-231细胞增殖、有丝分裂的作用与前人部分研究结果差异较大，考虑前人研究多选取单一丹参提取物，本研究中丹参注射液原药成分保存较完整，成分复杂，作用靶点部位较多所致。本研究为体外实验，中药发挥作用的方式复杂，临床中需要摄入体内，通过胃肠道复杂的代谢转化成有活性的产物而发挥作用。因此需进一步体内实验明确丹参的安全剂量及其作用的途径与原理。

[1]Rakha E A,Reis-filho J S,Ellis I O.Basal-like breast Cancer:a critical review[J].Journal of Clinical Oncology:Official Journal of the American Society of Clinical Oncology,2008,26(15):2568.

[2]Rakha E A,Reis-filho J S,Ellis I O.Impact of basal-like breast carcinoma determination for a more specific therapy[J].Pathobiology,2008,75(2):95-103.

[3]王若光,尤昭玲,马红霞.植物性雌激素与中药有效成分的相关性[J].中医药学报,2003,31(5):31-32.

[4]Wu Fei,Safe S.Differential activation of wild-type estrogen receptor alpha and C-terminal deletion mutants by estrogens,antiestrogens and xenoestrogens in breast Cancer cells[J].Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,2007,103(1):1-9.

[5]敬静,郑鸿,王静,等.丹参酮ⅡA对人ER阴性乳腺癌细多耐药逆转作用[J].四川大学学报(医学版),2007,38(3):158-160.

[6]翁时秋,王小云,丁志云,等.丹参酮ⅡA抑fIYL腺癌转移相关基因GEP100表达的实验研究[J].江苏中医药,2011,43(12):80-81.

[7]张欣,张蒲蓉,陈洁,等.丹参酮ⅡA对乳腺癌抑制作用的体内实验研究[J].四川大学学报(医学版),2010,41(1):62.

[8]Chrzan B G,Bradford P G.Phytoestrogens activate estrogen receptor betal and estrogenic responses in human breast and bone Cancer cell lines[J].Molecular Nutrition & Food Research,2007,51(2):171-177.

[9]Powell E,Shanle E,Brinkman A,et al.Identification of estrogen receptor dimer selective ligands reveals growth-inhibitory effects on cells that co-express ERα and ERβ[J].PloS One,2012,7(2):e30993.

[10]Barone M,Lofano K,DE Tullio N,et al.Dietary,endocrine,and metabolic factors in the development of colorectal Cancer[J].Journal of Gastrointestinal Cancer,2012,43(1):13-19.

[11]刘永惠,郭少贤,常靖,等.丹参酮对血瘀证乳腺癌P53基因、mdm2基因表达的影响[J].陕西中医,2011,32(12):1666-1667.