静力负荷对大鼠骨骼肌线粒体及肌浆网功能的影响

王灿，杨成君，尹忠伟

(1.沈阳医学院公共卫生学院职业卫生与职业医学教研室，辽宁沈阳110034;2.沈阳军区疾病预防控制中心)

随着科学技术的进步，生产力的发展，生产劳动中自动化、机械化的程度越来越高，有越来越多的作业要求劳动者长期维持某种固定作业体位，静力负荷所致肌肉损伤的发病率呈现逐渐上升的趋势。在一些工业化国家已成为主要的职业健康问题，欧美等国已将其列入职业病范畴。在我国职业性肌肉骨骼损伤也日益严重，有调查显示黄石市冶金、建筑、纺织3种行业中主要作业工人肌肉骨骼疾患的总患病率为87.32%［1］，一些调查显示在铸造行业，下背痛患病率为88.40%;焊接工下背痛患病率为41.55%［2］。因此，研究静力负荷所致肌肉损伤的机制具有重要意义。目前研究认为细胞内钙失衡、自由基产生、能量代谢等因素是长期静力负荷致骨骼肌损伤的主要机制，通过观察Ca2+、Ca2+-ATPase、丙二醛 (malondialchehyche，MDA)在骨骼肌线粒体与肌浆网中的变化，探讨静力负荷致骨骼肌损伤的机制，为此我们开展了本次研究。

1 实验动物和方法

1.1 实验动物及分组 实验动物由沈阳医学院实验动物中心提供，实验动物使用许可证号:SYXK(辽)2010-0002。常规分笼饲养，自由饮食进水，室温20～22℃，相对湿度50% ～60%，自动控制器进行空气调节，饲养1周后进行实验。选取16只雄性Wistar大鼠，体重200～220 g，随机分为对照组、负荷组，每组8只。

1.2 方法

1.2.1 动物处理方法 用2%戊巴比妥钠40 mg/kg经腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠四肢固定在解剖板上，剪开左下肢皮肤，游离比目鱼肌远端，施加100 g负荷，将大鼠上肢固定在高60 cm的铁架上，负荷90 min，对照组以同样的方式处理，只是不施加负荷 (图1)。

图1 左下肢比目鱼肌施加100 g负荷90 min的大鼠

1.2.2 大鼠比目鱼肌线粒体及肌浆网的制备 线粒体悬液的制备:负荷实验结束后取出部分比目鱼肌，在4℃生理盐水中漂洗除去血液，用试纸擦干，称重，放入10 ml小烧杯内，加入9倍于组织块重量的生理盐水，将组织块剪碎，用玻璃匀浆器，手工匀浆8 min，将匀浆液3 000r/min离心10 min，留上清得10%组织匀浆液。取10%的组织匀浆液，9 000 r/min离心20 min，沉淀物为线粒体。将得到的线粒体沉淀加生理盐水2 m l，用玻璃匀浆器，手工匀浆8 min，得到破碎的线粒体悬液，待测。分离出线粒体后的骨骼肌胞浆液经40 000 r/min，离心15 min，得到肌浆网沉淀。取下层沉淀的肌浆网，加1 m l4℃生理盐水，研磨6～8 min，制成肌浆网悬浮液，待测，整个处理过程在1～4℃条件下完成。

1.2.3 生化指标测定方法 (1)钙浓度测定:取待测样品0.1 m l于10 ml清洁小烧杯中，加5 m l浓硝酸 (分析纯)消化24 h，于自控电热消化吸收器中 (120℃)挥发至溶液无色，在原子吸收分光光度计上测定659 nm处吸光度值，并计算钙含量，以每克蛋白水平 (μmol/g)表示。蛋白定量采用南京建成生物研究所提供的考马斯亮蓝显色剂测定;(2)Ca2+-ATPase测定:取0.2 ml线粒体悬液，采用南京建成生物研究所提供的试剂盒测定。通过酶促水解ATP生成无机磷的水平来表示酶的活力，以mmol/g表示 (试剂盒说明书上定义:规定每小时每毫克组织蛋白的组织中ATP酶分解ATP产生1μmol无机磷的量为1个ATP酶活力单位。即每小时每微摩尔分子磷/毫克蛋白);(3)MDA水平测定:取0.2 ml待测液，MDA采用南京建城生物研究所提供试剂盒测定。其原理是过氧化脂质降解产物中的MDA可与硫代巴比妥酸缩合形成红色产物，在532 nm处有最大吸光度。结果以每克蛋白表示 (μmol/g)。

1.3 统计学分析 应用SPSS10.0软件对数据进行正态性检验，组间比较采用两个独立样本的t检验;结果用±s表示;P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 大鼠骨骼肌线粒体生化指标的变化 负荷组与对照组相比，线粒体Ca2+浓度增加111.11%(t=3.201，P=0.006);Ca2+-ATPase活力下降25.88%(t=3.047，P=0.009);MDA含量增加188.57%(t=7.619，P=0.000)，见表1。

表1 两组大鼠骨骼肌线粒体Ca2+、Ca2+-ATPase、MDA的比较 (n=8，±s)

表1 两组大鼠骨骼肌线粒体Ca2+、Ca2+-ATPase、MDA的比较 (n=8，±s)

注:与对照组比较1)P＜0.01

组别 Ca(μmol/g) Ca-ATPase(mmol/g) MDA(μmol/g)对照组1.62±0.64 22.41±4.20 2.45±0.70负荷组 3.42±1.461) 16.61±3.361) 7.07±1.561)

2.2 大鼠骨骼肌肌浆网生化指标的变化 负荷组与对照组相比较，骨骼肌肌浆网 Ca2+浓度下降75.89%(t=7.152，P=0.000);Ca2+-ATPase活力下降61.49%(t=7.913，P=0.000);MDA含量增加122.86%(t=8.012，P=0.000)，见表2。

表2 两组大鼠骨骼肌肌浆网Ca2+、Ca2+-ATPase、MDA的比较 (n=8，±s)

表2 两组大鼠骨骼肌肌浆网Ca2+、Ca2+-ATPase、MDA的比较 (n=8，±s)

注:与对照组比较1)P＜0.01

组别 Ca2+(μmol/g) Ca2+-ATPase(mmol/g) MDA(μmol/g)对照组2.24±0.63 4.70±0.81 4.55±1.29负荷组 0.54±0.231) 1.81±0.641) 10.14±1.501)

3 讨论

细胞质中Ca2+浓度的变化调节着细胞许多基本生理功能，对于静息状态肌细胞，30%的钙贮存于线粒体中，14%存在于肌浆网，由于线粒体和肌浆网中钙量比细胞质高出几百倍，常把这两种亚细胞结构视为细胞钙库。线粒体和肌浆网调控着 Ca2+的转运，对维持胞质 Ca2+浓度极低(0.1微克分子)的稳态起重要意义［3］。骨骼肌线粒体是细胞的呼吸器官，是细胞能量代谢的中心，细胞生命活动所需能量约95%由线粒体通过电子传递链反应，它通过氧化磷酸化生成ATP供给细胞需要［4］。线粒体又是细胞Ca2+的缓冲器，具有摄取、释放Ca2+以及调节胞浆Ca2+浓度的能力。它通过钙的摄取与释放调节钙含量，以维持细胞的功能。线粒体又是对缺氧最敏感的细胞器。有研究显示骨骼肌长期处于静力负荷下，会引起局部肌肉紧张度增加，压迫血管，导致肌肉血液供应不足和供氧不足、ATP减少、代谢物不断堆积及自由基增多等方面的变化。本实验对大鼠比目鱼肌施加100 g静力负荷，90 min后，负荷组与对照组比较，线粒体Ca2+浓度升高111.11%、Ca2+-ATPase活性下降25.88%、MDA升高188.57%，差异有显著性。其原因一是可能与骨骼肌长时间收缩产生的机械牵拉，使细胞外的Ca2+通过细胞膜上的牵拉性Ca2+通道进入肌细胞。二是长时间负荷作用于骨骼肌，胞浆Ca2+浓度会应激性增加，不能维持胞浆内低钙水平，线粒体依靠耗能的内流机制摄取Ca2+以缓冲胞浆中Ca2+的过度增加，造成线粒体Ca2+超载，线粒体内Ca2+浓度的增加，抑制了自身氧化磷酸化过程，减少ATP生成。同时，缺血缺氧使肌肉无氧酵解增强，引发脂质过氧化反应，其产物MDA和自由基均可对膜系统造成攻击，膜损伤的后果是氧化磷酸化解偶联，ATP生成减少，钙泵酶活力降低，ATP生成减少使细胞能量代谢受到障碍。线粒体内Ca2+增高，Ca2+-ATPase活力下降和MDA增多，三者共同影响着线粒体正常功能，成为骨骼肌细胞损伤的机制之一。此结果与何丽华等对家兔实施静力负荷研究结果相同［5］。

肌浆网是骨骼肌调节细胞Ca2+浓度的生要的细胞器之一，在肌肉兴奋－收缩偶联过程中起关键作用。静息时胞浆内游离Ca2+浓度极低，肌肉处于松驰状态;肌肉兴奋时，肌浆网释放Ca2+，通过一系列反应引起肌纤维收缩;兴奋停止后肌浆网通过钙泵消耗能量，将Ca2+重新摄入肌浆网。骨骼肌在长时间负荷作用下，代谢物堆积及自由基的产生，能量的消耗，使肌浆网摄入Ca2+能力下降。本实验结果，负荷组与对照组比较，肌浆网Ca2+浓度下降75.89%，Ca2+-ATPase活力下降61.49%，MDA含量增加122.86%。肌浆网摄钙能力下降可能与Ca2+-ATPase活力下降、MDA增加、ATP的消耗有关。由于肌浆网摄取Ca2+能力下降，造成胞浆Ca2+平衡紊乱，加重线粒体钙超载，可能成为骨骼肌细胞损伤的主要原因之一。本结果与王翔等［6］、王生等［7］的研究结果相一致。实验结果表明，长时间静力负荷作用于机体局部，引起的骨骼肌损伤与骨骼肌线粒体钙超载和肌浆网摄钙能力下降、肌浆网、线粒体膜Ca2+-ATPase活力下降、MDA增多有关。

［1］张俐娜，张红娣，万松泉，等.三种行业工人职业性肌肉骨骼疾患调查分析 ［J］.公共卫生与预防医学，2006，17(2):47－48.

［2］白璐，王建新，岳朋朋.职业性肌肉骨骼疾患研究现状 ［J］.中国工业医学杂志，2009，22(5):356－359.

［3］宋今丹.医学细胞生物学 ［M］.北京:人民卫生出版社，2004:143－157.

［4］刘晔.骨骼肌静力性负荷所致损伤机理的研究［M］.北京:北京体育大学出版社，2010:12.

［5］何丽华，王生，郑强，等.静态负荷致骨骼肌损伤中线粒体功能的变化 ［J］.中国职业医学，2001，28(2):2－4.

［6］王翔，魏源.力竭运动后大鼠骨骼肌不同肌纤维线粒体钙含量和肌浆网Ca2+－ATP酶活力变化 ［J］.浙江体育科学，2002，24(2):50－52.

［7］王生，郑强，何丽华，等.静态负荷对家兔骨骼肌胞浆Ca2+含量及肌浆网功能的影响 ［J］.中华劳动卫生杂志，2000，18(6):327－329.