多巴胺D2、D3受体基因多态性与汉族人精神分裂症相关研究☆

刘书莲程晓丽温雯静刘华李文超钟红梅

多巴胺D2、D3受体基因多态性与汉族人精神分裂症相关研究☆

刘书莲*△※程晓丽☆温雯静＃刘华*李文超△钟红梅◎

目的探索多巴胺D2受体（Dopamine D2receptor，DRD2）基因第8外显子Taq I A位点多态和多巴胺D3受体（Dopamine D3receptor，DRD3）基因第5内含子Msp I位点多态与汉族人群精神分裂症是否关联及其在不同性别是否存有差异。方法使用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性 （Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）及DNA测序技术，对317例精神分裂症患者及310名对照DRD2Taq I A基因多态性和DRD3Msp I位点基因多态性进行检测。结果患者组与对照组间DRD2 Taq I A位点等位基因分布差异显著（P＜0.01）、两两基因型对比（A1／A2与A1／A1相比：P＜0.05；A2／A2与A1／A1相比：P＜0.01）及两基因型联合对比（A1／A2＋A2／A2与A1／A1：P＜0.01）组间差异也显著。性别分层研究DRD2Taq I A位点女性组间差异显著（P＜0.01），男性组间差异无意义（P＞0.05）。DRD3Msp I位点的基因型频率、等位基因分布及性别分层分析等所有数据均显示患者组与对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。风险因子趋势检验结果DRD2Taq I A位点等位基因 A2：P＜0.01；DRD3Msp I位点等位基因2：P＞0.05。结论所得数据支持DRD2Taq I A位点等位基因 A2可能为精神分裂发生的风险因子，特别对女性而言。数据分析不支持DRD3Msp I位点基因与精神分裂发生有关。此结果需更进一步研究证实。

精神分裂症 基因多态 多巴胺D2受体 多巴胺D3受体

精神分裂症（schizophrenia，SZ）患者占精神病院总数住院人数的80～90%以上，终生发病率约为1%。精神分裂症的发生受遗传和环境因素共同影响，为多基因遗传病［1］。多巴胺D2受体（dopamine D2receptor，DRD2）基因在人脑内尾状核表达最高，多巴胺D3受体（dopamine D3receptor，DRD3）基因几乎只表达在大脑的边缘系统，此区域被认为与情绪控制有关［2］。DRD2、DRD3两基因是否为精神分裂症易感基因的研究一直是众多学者关心的热点之一，但各项研究仍无定论，由于样本量的限制，性别分层研究数据更加稀少。DRD2、DRD3基因多态及其等位基因频率分布存在明显种族或（和）地域差异，且国内精神分裂证的分子病因学研究相对滞后。扩展及加强相关研究十分必要。本研究对汉族人精神分裂症患者DRD2基因第8外显子下游10 kb处Taq I A位点与DRD3基因第5内含子下游532位碱基Msp I位点多态分布差异进行整体分析及性别分层研究，以评价其对精神分裂的影响、丰富相关分子病因学数据库。

1 材料和方法

1.1 研究对象 来自2008年至2010年河南省洛阳荣康医院、郑州市精神病防治医院的精神分裂症住院患者。入组标准：①符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-Ⅳedition，DSM-Ⅳ）的精神分裂症诊断标准［3］；②汉族，病程 2年以上；③精神分裂症阳性与阴性症状量表（Positive and Negative Syndrome Scale，PANSS）评定＞45分。排除标准：①合并有人格障碍或精神发育迟滞、脑器质性损伤者；②癫痫、癌症、肝肾功能不全、接受器官移植、严重营养不良等疾病者；③酒精依赖及其它精神活性物质滥用史者、有内分泌疾病者。共317例患者，其中男206例，女111例，年龄16～55岁，平均（40.36±9.60）岁。

另择同期两医院健康体检的随机个体为正常对照，入组标准：汉族，与患者无血缘关系、无各种精神疾病或其他严重疾患者。共310名，其中男203名，女107名，年龄17～58岁，平均（35.66±6.41）。两组个体均为监护人或本人知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取 患者组个体于入院后、用药前、清晨、空腹（对照组个体于体检时清晨、空腹）取外周静脉血3～5 mL，EDTA抗凝，应用标准酚－氯仿法提取基因组DNA［4］，无水乙醇、NaCl沉淀，去离子水溶解，－20℃冻存。

1.2.2 引物设计 由上海生工生物公司合成引物，见表1。

表1 各位点引物序列

1.2.3 PCR扩增 所有样本PCR反应体系采用：STR 10×Buffer 2.5 μL、上下游引物（5 umol／L）各2 μL、TaqDNA聚合酶0.3 μL／1U、模板DNA 1.5 μL、纯水补至25 μL，DRD2基因PCR条件：以95℃预变性5 min，94℃变性 60 s，60℃退火 45 s，72℃延伸60 s，共30个循环，72℃延伸5 min。DRD3基因PCR条件：95℃预变性5 min；94℃变性60 s，54℃退火45 s，72℃延伸60 s，30个循环；72℃延伸5 min。

1.2.4 琼脂糖凝胶电泳 用Promega公司Taq I A、MspI酶分别消化DRD2、DRD3基因扩增产物4～6 h，2%的琼脂糖凝胶电泳0.5～1 h，电压100V，在紫外线成像仪上检测分析基因型。

DRD2基因扩增片段为310 bp，经限制性内切酶Taq I消化，根据有无酶切位点确定基因型：纯合野生型（A1／A1型）无酶切为点可见一个310 bp带型；纯合突变型（A2／A2型）酶切后产生180 bp，130 bp两条带；杂合型（A1／A2型）酶切后产生310 bp，180 bp和130 bp三条带（图1）。

图1 DRD2Taq I A位点PCR产物Taq I酶切电泳图 M：100 bp分子量标准；1、3、6：A1／A2基因型；2、4、5：A1／A1基因型；7：空白对照；8：A2／A2基因型

DRD3基因扩增片段为396 bp，经限制性内切酶Msp I消化，根据有无Msp I酶切位点确定基因型：纯合野生型（1／1型）无酶切位点产生一条396 bp带型；纯合突变型（2／2型）酶切后产生 252 bp，144 bp两条带；杂合型（1／2型）酶切后产生396 bp、252 bp、144 bp三条带（图2）。

图2 DRD3Msp I位点PCR产物Msp I酶切图谱 M：100 bp分子量标准；1、6：1／1基因型；2：空白对照；3、5、7：1／2基因型；4：2／2基因型

1.3 统计学方法 用Pearson卡方检验对Hardy-Weinberg平衡进行评估，平衡标准P＞0.05。应用SPSS 16.0软件包作统计学处理。患者组与对照组等位基因和基因型频率差异用χ2检验 （频数小于5时应用对数似然比卡方精确检验），计算比值比（Odds Ratio，OR）及95%可信区间（CI），估计基因突变对疾病发生的相对危险度。应用科克伦－阿米蒂奇趋势检验（Cochran-Armitage trend test）进行关联分析。检验水准α＝0.05，双侧检验。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg平衡检验 患者组和对照组DRD2Taq I A位点基因型多态性分布（χ2＝1.00，P＞0.05；χ2＝0.91，P＞0.05）符合Hardy-Weinberg平衡；两组DRD3Msp I位点基因型多态性分布也均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝0.65，P＞0.05：对照组χ2＝0.17，P＞0.05），随机选择样本均具有良好的人群代表性，等位基因的检验在混合群体中均为有效检验。

2.2 两组DRD2Taq I A位点组间基因型和等位基因分布的比较 患者组DRD2Taq I A位点的A2等位基因频率明显高于对照组（χ2＝25.56，P＜0.01，OR＝1.80，95%CI：1.43～2.27）。患者组与对照组之间基因型分布见表1，经卡方检验，基因型两两比较（A1／A2与A1／A1、A2／A2与A1／A1）均具有统计学意义，其中杂合基因型A1／A2与精神分裂症发生有一定相关，χ2＝6.25，P＜0.05，OR＝1.82，95%CI：1.13～2.91；而A2／A2基因型与精神分裂症发生呈显著相关，χ2＝23.09，P＜0.01，OR＝3.24， 95%CI：1.98～5.28。两种基因型联合比较（A1／A2＋A2／A2与A1／A1）结果也显示为显著相关，χ2＝14.46，P＜0.01，OR＝2.34，95%CI：1.49～3.65。

表1 组间DRD2Taq I A位点基因型和等位基因型分布的比较 例（%）

2.3 两组DRD3Msp I位点组间基因型和等位基因分布的比较 DRD3Msp I位点基因和基因型分布见表2。患者组DRD3Msp I位点等位基因2的频率与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），经卡方检验，三种基因型的两两比较（1／2与1／1型、2／2与1／1型比较比较）组间差异不具统计学意义（P＞0.05）。两种基因型联合（1／2＋2／2与1／1）比较结果也显示为无意义（P＞0.05）。

表2 组间DRD3Msp I位点基因型和等位基因型分布的比较 例（%）

2.4 DRD2Taq I A位点男、女基因型和等位基因组间分布的比较 DRD2 Taq I A位点男、女等位基因、基因型分布分别见表3。男性等位基因组间差异有统计学意义（χ2＝4.69，P＜0.05，OR＝1.38，95%CI：1.03～1.86）。经卡方检验，基因型两两比较（A1／A2与A1／A1、A2／A2与A1／A1）及两种基因型联合比较（A1／A2＋A2／A2与A1／A1）结果均无统计学意义（P＞0.05）。女性等位基因组间差异显著，有统计学意义（χ2＝32.4，P＜0.01，OR＝3.07，95%CI：2.08～4.55）。基因型两两比较（A1／A2与A1／A1：χ2＝8.15，P＜0.05，OR＝2.61，95%CI：1.34～5.07；A2／A2与A1／A1：χ2＝31.81，P＜0.01，OR＝11.36，95%CI：4.59～28.09）及两种基因型联合比较（A1／A2＋A2／A2与A1／A1：χ2＝18.83，P＜0.01，OR＝3.89，95%CI：2.07～7.34）组间均有显著差异，具统计学意义。

表3 组间男、女DRD2Taq I A位点基因型和等位基因分布的比较 例（%）

2.5 DRD3Msp I位点男、女基因型和等位基因组间分布的比较 DRD3Msp I位点男、女性等位基因、基因型分布分别见表4。经χ2检验（频数小于5时应用对数似然比卡方精确检验），男、女等位基因、三种基因型两两比较及两种基因型联合比较等组间差异结果均无统计学意义（P＞0.05）。

表4 组间男、女DRD3Msp I位点基因型和等位基因分布的比较 例（%）

2.6 风险因子趋势综合评价 DRD2Taq I A位点A2基因与精神分裂发生相关性科克伦－阿米蒂奇趋势检验综合值：χ2＝24.91，P＜0.05；DRD3Msp I位点基因2综合值：χ2＝0.04，P＞0.05。

3 讨论

DRD2、DRD3为D2多巴胺受体的两个亚型，同属于G蛋白偶联受体，可抑制腺苷酸环化酶的活性，使cAMP水平降低，是精神疾病研究的热点部位。Noble EP等［5］研究认为DRD2Taq I A多态性与精神疾病、急性应激障碍相关联，A1等位基因携带者可能易感精神分裂，该类个体纹状体的DRD2密度、结合效率、葡萄糖代谢显著降低，但其多巴胺转运的密度显著升高。Dubertret C等［6］的相关研究则发现与对照组相比精神分裂症患者组A2基因表达显著增高。Parsons MJ等［7］对DRD2基因的两个相关多肽位点Taq I A1／A2（rs1800497）和－141－C插入／缺失（rs1799732）突变的研究支持也DRD2 A2等位基因与精神分裂症有一定相关。Bertolino A等［8］相关研究证实DRD2受体信号是强烈影响精神分裂症的发生因素。本研究分析发现DRD2Taq I A位点患者组各基因型比率随A2基因数增多而增高：A1／A1（10.7%）；A1／A2（43.8%）；A2／A2（45.5%），而对照组各基因型比率则为A1／A1（21.9%）；A1／A2（49.4%）；A2／A2（28.7%），从等位基因频率看，患者组A2频率（67.4%）明显高于对照组（53.4%），基因型联合比较（A1／A2＋A2／A2与A1／A1）分析也显示患者组与对照组间差异显著，据此，本研究综合结果指向：DRD2Taq I A基因位点等位基因A2可能是精神分裂的风险因子。

进一步观察分析DRD2Taq I A位点等位基因A2对男、女不同性别的影响是否存有差别时发现女性患者组A2等位基因频率较对照组（59.9%vs 32.7%）高，女性患者组A2／A2基因型比率达36.1%，而对照组只有8.4%，两种基因型的联合比较（A1／A2＋A2／A2与A1／A1）结果同样显示组间存在显著差异。而在男性的分层研究中，患者组A2等位基因频率虽然较对照组（71.4%vs 64.3%）高，但基因型两两比较与两种基因型联合比较中组间差异均无统计学意义。由此分层分析结果提示：DRD2基因Taq I A位点可能与女性精神分裂症的发生有一定相关。Behravan J［13］2008年对伊朗精神分裂症患者进行性别分层研究也发现女性患者DRD2A2等位基因的频率较对照组高（45%vs 32%），经检验差异具有统计学意义，男性组间无差别。DRD2基因Taq I A位点被认为是DRD2基因的多态性标志，其等位基因频率分布也存在明显种族或（和）地域差异［2］，扩大样本量及联合临床相关激素水平变化的观察等研究，对进一步证实该基因位点在不同种族、不同性别精神分裂发生中所起的作用十分重要。

内含子突变与疾病关系的研究虽起步较晚，但日渐深入，内含子已被认为具有多样性功能，如既有增强子作用，也起抑制作用，既能充当启动子，也可充当介导因子，内含子还被认为能参与RNA编辑等。目前Hu Z和Abou-Elew H［14，15］分别研究发现一些内含子突变及多态性与多种疾病的发生及易感相关。Griffon等［16］首先研究发现DRD3基因第5内含子下游532位碱基上存在一个Msp I多态性位点，并将此位点引入非葡萄牙裔白种人精神分裂的研究中，但未发现与之相关。Nunokawa A等［12］两次对日本595名和2126名精神分裂患者DRD3基因多个位点的研究未发现任何相关因子。Krelling R等［9］对巴西人群的研究也不支持 DRD3等候选基因多态性与精神分类易感性相关。而Talkowski ME等［10］在两个独立的美国白人样本筛选18个多巴胺相关基因的研究中确认DRD3与精神分裂的发生相关。Zhang F等［11］研究结果支持DRD3可能参与中国汉族人群精神分裂发生。本研究在DRD3Msp I位点多态对汉族人群精神分裂的影响所进行的尝试性研究结果无统计学意义，性别分层研究结果组间差异也无意义，不支持DRD3Msp I位点基因多态与精神分裂发生有关。DRD3基因第5内含子精神分裂遗传病因学的研究中是一个新的观察点，其在精神疾病发生方面的影响仍需大量研究证实。

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DRD2，DRD3gene polymorphism related research with schizophrenia of Han population

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LIU Shulian，CHENG Xiaoli，WEN Wenjing，LIU Hua，LI Wenchao，ZHONG Hongmei.Department of Cell Biology and Medical Genetics，College of Basic Medical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China.Tel：0371－66658161

ObjectiveTo study the impact of dopamine D2receptor（DRD2） gene exon 8 Taq I A and dopamine D2receptor（DRD3）Gene intron 5 Msp I polymorphism in schizophrenia（SZ）of the Han Population，and are there any difference between male and female.MethodsPolymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP）and DNA sequence were used to determine the mutation of DRD2Taq I A，DRD3Msp I polymorphism of 317 patients and 310 healthy controls.ResultsThe statistical analyses show that there have significant difference of distribution between SZ and control group of DRD2Taq I A allele frequencies （P＜0.01）， and the genotype（A1／A2 vs.A1／A1：P＜0.05；A2／A2 vs.A1／A1：P＜0.01）.The two genotypes joint contrast（A1／A2＋A2／A2 and A1／A1：P＜0.01）difference between the groups was also significantly.The gender stratification analysis of DRD2Taq I A genes show significant differences（P＜0.01）between female patients and control groups，and meaningless in men（P＞0.05）.All analytical data show that there have no significant differences of distribution between patients and control group of DRD3Msp I gene （P＞0.05）.The test results of risk factor trends for DRD2Taq I A allele A2 P＜0.01； DRD3Msp I alleles 2 P＞0.05. Conclusion The data support the DRD2Taq I A allele A2 might be a risk factor for schizophrenia， especially for women.And the data does not support the occurrence of DRD3Msp I gene and schizophrenia.Larger study populations are needed to confirm our findings.

Schizophrenia Gene Polymorphism Dopamine D2receptor Dopamine D3receptor

R749.3

A

2011－10－11）

（责任编辑：文飞）

10.3969／j.issn.1002－0152.2012.03.004

☆ 河南省医学科技攻关资助项目（编号：200903006）

* 郑州大学基础医学院细胞生物学与医学遗传学教研室（郑州 450052）

△ 河南省洛阳荣康医院

※ 郑州卫校基础护理教学部

＃ 河南漯河医学高等专科学校

◎ 西南民族大学生命科学与技术学院