HPLC法同时测定火绒草中木犀草苷和咖啡酸的含量

杨 梓 樊 晖 张 慧 张宇瑶 翟延君*

1.辽宁中医药大学，辽宁 大连 116600;2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032

火绒草 Leontopodium Leontop odioides(wild.)Beauv.别名:老头草、薄雪草、老艾头。系菊科火绒草属植物火绒草的干燥全草。夏、秋季采割，以地上全草入药。多生于草原、山坡、地埂等处，广泛分布于我国东北、西北、华北和西南等地。野生资源极其丰富，是我国北方民间常用中草药之一［1］。性寒，味微苦，入肾、膀胱二经。具有清热凉血、消炎利尿等功效。其对流行感冒，急、慢性肾炎，尿路感染，尿血，创伤出血等症状有一定的治疗作用。蒙医用于肺热咳嗽，咳痰不爽，肺脓疡，喘咳，痰中带血，感冒咳嗽的治疗;藏医用于治疗流行性感冒，瘟病时疫，矿物药中毒，砒霜中毒，肉瘤，疮疖疔毒，出血亦可作艾炙用［2］。

李礼［3］等人在火绒草的化学成分研究中从火绒草的乙醇提取物中分离得到木犀草苷、小檗碱、阿魏酸、咖啡酸和香草酸等14种化合物。其有效成分之一咖啡酸具有止痛、抗炎症、抗肝毒、抗溃疡等作用，与火绒草用于尿路感染有关［4］。虽然火绒草的部分活性成分已明确，但其含量测定方法尚未见报道，本实验建立了HPLC法同时测定火绒草中木犀草苷和咖啡酸含量的方法，为其品质评价提供了一定的科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪 (美国Agilent公司)，G1379A真空脱气机，G1311A四元梯度泵，G1313A自动进样器，G1315A柱恒温箱，G1315B二极管阵列检测器，Agilent B 04.03化学工作站;AE－240电子分析天平;SHB－ⅢA循环水式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司);HN101－3A型电热鼓风干燥箱 (南通沪南科学仪器有限公司);DK－98－1型电热恒温水浴箱 (天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试药 火绒草药材 (购自河北安国，由辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为菊科火绒草属火绒草);木犀草苷对照品:由中国药品生物制品检定所提供，批号为111720－200603，咖啡酸对照品:由中国药品生物制品检定所提供，批号为110885－200102，甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:采用Agilent TC－C18(250 mm×4.6 mm，5μm)色谱柱;流动相:乙腈为流动相A，0.5%冰醋酸为流动相B，按下表进行梯度洗脱 (表1);柱温:25℃;检测器:DAD;检测波长:咖啡酸的检测波长为320nm，木犀草苷的检测波长为350nm;流速:1 mL/min;

2.2 对照品溶液的制备 取木犀草苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含29.6μg的溶液，即得。取咖啡酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含760μg的溶液，即得。

表1 流动相梯度洗脱时间表

2.3 供试品溶液的制备 取本品约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50mL，称定重量，超声处理 (功率250w频率35kHz)1小时，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，回收溶剂至干，残渣用70%乙醇溶解，转移至5mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，即得。

2.4 线性关系的考察 取木犀草苷对照品溶液分别进样5、10、15、20、25μL，记录色谱峰面积。取咖啡酸对照品溶液分别进样0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μL，记录色谱峰面积。以进样量 (ug)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。经线性回归，木犀草苷的回归方程为Y=2070.541X+219.04，r=0.9996;咖啡酸的回归方程为Y=5230.132X+112.57，r=0.9997。结果表明木犀草苷在0.148μg～0.74μg，咖啡酸在0.076μg～0.38μg范围内各峰面积与进样量呈良好的线性关系。

2.5 稳定性试验 同一供试品溶液于室温条件放置，于0、2、4、6、8h分别精密吸取5μL进样，测定，记录峰面积值，结果木犀草苷峰面积在8小时内测定结果稳定，RSD为1.03%;咖啡酸峰面积在8小时内测定结果稳定，RSD为1.67%。

2.6 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液，进样5μL，重复进样6次，木犀草苷峰面积RSD为0.52%;咖啡酸峰面积RSD为1.88%。结果表明，精密度良好，符合定量分析要求。2.7 重复性试验 分别取同一批供试品，按样品测定项下方法，重复制备样品6次，进行测定，计算木犀草苷的平均含量RSD为1.38%;咖啡酸的平均含量RSD为1.91%。结果表明，供试品制备方法重复性良好。

2.8 回收率试验 取已知含量的木犀草苷和咖啡酸的样品约0.4g，共6份，分别精密加入木犀草苷和咖啡酸对照品各0.1mg，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液。按上述色谱条件进行测定，计算回收率。结果表明，木犀草苷加样回收率为96.2%，RSD为1.13%;咖啡酸加样回收率为98.4%，RSD为2.29%。符合定量分析要求。

2.9 样品含量测定 取3批中试样品，按2.3项下方法制备供试液，按上述色谱条件进行测定，结果见表2。

表2 样品测定结果 (n=3)

3 讨论

本实验首次采用高效液相色谱法同时测定火绒草中木犀草苷和咖啡酸的含量，由于提取物是由火绒草单味药经75%乙醇提取而成，不需要过多的处理方法，即可将指标成分较好的分离。故本实验采取溶剂提取法制备含测样品。之后又比较了70%的乙醇回流提取和超声提取法的提取效率，差别不大，而且超声提取方法简便，故本方法最终采用70%的乙醇超声提取，制备供试品溶液。本实验采用乙腈－0.5%冰醋酸作为流动相进行梯度洗脱，咖啡酸在12min左右出峰，木犀草苷在21min左右出峰，获得良好的分离度和峰形，并分别对精密度、稳定性、重复性和回收率进行了考察，结果表明本文介绍的测定方法准确可靠、操作简单、回收率合格，为火绒草药材的质量控制提供了实验依据。

［1］《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编 (上册，第2版)［M］.北京:人民卫生出版社，1996:14.

［2］刘轩，邸子真，初正云，等.火绒草的生药学鉴定研究［J］.辽宁中医药大学学报，2009，11(8):217－218.

［3］李礼.火绒草的化学成分研究［D］.沈阳药科大学，2008.

［4］董玉，马强，那生桑，等.高效液相色谱法测定蒙药冬葵果中咖啡酸的含量［J］.北京中医药大学学报，2010，33(2):117－119.

［5］国家药典委员会.中国药典 (一部)［S］.北京:化学工业出版社，2010.