微流控PCR芯片研究进展及其在法医DNA检验中的应用

董军磊，欧 元，李彩霞，徐建栋，叶 健

（1.中国人民公安大学，北京 100038；2.公安部物证鉴定中心，北京 100038；3.北京理工大学，北京 100081）

1 引言

聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR)是1985 年美国 Cetus 公司的 Mullis等人发明的一种具有里程碑意义的新技术，使得核酸的体外无限扩增成为现实。随着第一台PCR热循环仪的问世，PCR技术作为一种重要的手段，被广泛地应用到分子生物学和基因工程实验室、疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药开发和工农业制品的开发等方面[1]。

得益于阵列毛细管电泳等先进检测技术的发展，人类基因组计划提前完成，这让人们越来越认识到检测工具的重要性。随着后基因时代的到来，待检测样本量日益增大，这需要对大量样本进行快速PCR，同时新的分析方法和检测技术也推动检测仪器向微型化、自动化、快速化、集成化、便携化发展。1990年，Manz和Widmer把当时微电子领域已经发展成熟的微电机加工技术(micro-electronic mechanical system，MEMS)作为加工平台来实现全部分析功能在芯片上的微型化，首次提出了微全分析系统（Micro Total Analysis System，μ-TAS ）的概念[2]，在此后的二十几年中发展成为世界上最前沿的科技领域之一。目前其核心技术即是以微流控技术（Microfluidics）为基础的微流控芯片。微流控PCR芯片是一种典型的用于DNA扩增反应的微流控芯片，它采用先进的MEMS技术，最大限度地将生化分析的操作步骤集成到芯片上，与常规热循环仪相比，具有微型化、消耗试剂少，升降温速度快、易于与其他装置集成等特点，成为芯片研究领域的热点。

2 微流控PCR芯片研究进展

2.1 制作材料

用于制作PCR芯片的材料主要有单晶硅、石英和玻璃、高分子聚合材料, 如光胶SU-8、聚二甲基硅氧烷( polydimethylsiloxane, PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate,PMMA)等。单晶硅是最早适用的芯片基材，加工工艺及相关设备完善，但硅材料易碎、价格贵、抗腐蚀性能不够好, 且对PCR反应抑制作用[3]。玻璃和石英有着很好的抗腐蚀性，且廉价易得。由于其制作工艺复杂，在一定程度上影响了其应用。聚合物材料品种多，价廉，无毒、易于大批量生产。其中PDMS是目前最常用的聚合物材料，因为它价格便宜，加工工艺简单，又有很好生物相容性和热稳定性。

2.2 制作方法

PCR芯片的制造，与多数微流控芯片一样，依据材料的不同有着不同的制作工艺。对于硅、玻璃等材料为主的微流控芯片主要采用光刻和蚀刻技术进行加工, 通过光刻和蚀刻技术可以在基底材料上获得各种形状和大小的微管道。使用LIGA(Lithographie、Galvanoformung、Abformung) 技术可以达到高分辨率刻蚀，但对设备和环境要求也非常高。聚合物芯片上的微结构一般采用模塑法、注塑法、热压法、软光刻(soft lithography)、激光烧蚀法、LIGA技术等方法[4]制成。

2.3 加热方式

微流控PCR芯片的加热方式一般根据加热源与微反应室的相对位置分为接触式加热和非接触式加热。

2.3.1 接触式加热

现有微流控PCR芯片多数都采用接触式加热方式，主要有分体式和集成式两种。分体式加热方式最简单的就是采用导热性好的铜块[5-7]或铝块[8-9]。另外一种常用的是采用珀耳帖（Peltier）半导体加热制冷片[8,10]，其上面为热面，下面为冷面，通过改变电流方向来使冷热面互换，温差可达60℃。还有报道通过化学反应进行加热和冷却[11]。分体式加热往往是外置的，加工简单，成本小，但热容较大，加热和冷却速度慢，不易于集成微型化。

相对于分体式加热方式，集成式加热方式是利用沉积、溅射等微加工技术直接将加热原件和测温原件集成在微流控芯片上，热容小，耗能低，集成化程度高。主要采用金属薄膜加工工艺，最常用的金属是铂（Pt），一般现在微反应室底部沉积一层钛或铬，实现金属铂与硅或玻璃的良好接触。也有用铝[12]、银[13]和钨[14]加热。氧化铟锡（ITO）[15-16]具有良好的透光性，也常被溅射到玻璃基片上，通过光刻技术形成加热器和温度传感器。

2.3.2 非接触式加热

采用非接触式热循环系统可提高热交换效率，不影响芯片加工。常用的非接触热源有红外线[17-18,37,46]、热空气[19]、激光[20]、微波[23]等。

2.4 微流控PCR芯片的分类

目前，根据热循环方式的不同，微流控PCR芯片主要分为静态腔室PCR芯片（Static chamber PCR）和连续流PCR芯片（Continuous-flow or flow-through PCR）两种模式。

2.4.1 静态腔室PCR芯片

静态腔室PCR芯片与传统PCR仪的工作原理类似，通过加热装置动态的温度变化，促使微室腔内的混合试样完成聚合酶链反应；由于腔室的体积小至几微升，因此热容非常小，可以实现快速加热和制冷，并且有利于实现多功能集成和制造。自从1993年Northrup[21]等采用MEMS技术首次在硅微流控芯片上成功实现静态PCR扩增以来，许多研究者从事静态腔室PCR芯片的研究工作，由于这种方法热循环次数不受限制，可以根据不同需要设计不同类型的腔室。

Poser等[22]在硅片上加工了2到10个微升级（5-10μl）的PCR芯片，并用淀积的方法在微芯片上集成微加热片和温度传感器作为微控温系统。升温速度为80℃/s，降温速度为40℃/s，温度变化可精确控制在0.1℃/s。Oh等[23]在玻璃上制作了4个约0.95μl的多微反应腔芯片。Shaw等[24]在玻璃制作了含有0.7μl微反应腔室的微流控PCR芯片，采用非接触式微波作为加热源,结合冷空气降温，热循环的升降温速率达65℃/s，温控偏差±0.5℃。Sundberg[25]等在塑料光盘制作1000个纳升级的微孔内，孔的容积为33μl，用离心法进行样品分装，用快速空气加热和实时荧光进行检测。完成循环用时33s，扩增效率达94%；300bp的质粒DNA样品在58-1000个孔内完成扩增和分析用时在50min以内，证明这种简易的圆盘PCR装置可以减少一次性品消耗和热循环时间。

2.4.2 连续流PCR芯片

1998年，Kopp[26]等首次报道了一种样品可在不同温度的恒温区间内连续流动的PCR芯片，三个温度区(95℃、77℃和60℃)由三个恒温铜块来实现，由驱动泵驱动PCR反应试样沿微通道顺序流经这三个温度区，并精确控制流速。在流动过程中实现变性、退火、延伸反应，完成扩增。这种连续流PCR不像静态腔PCR那样依赖温度随时间的变化，而是靠流过不同的恒温区实现扩增。PCR的扩增效率取决于混合试样在某一温区停留的实践，即该温区相应微通道的长度、通道截面积及混合试样的流速。由于连续流PCR芯片主要依靠流路微通道实现反应，具有热传递和热循环速度快的优点。但这中逶迤式连续流PCR芯片的循环次数是固定的，不便于灵活控制。

2003年Obeid 等[5]研制了一种连续流微流控型PCR 芯片，使其不仅能够实现 DNA 的扩增，还可以在芯片中完成 RNA 的逆转录过程，进而能够用于RNA 的逆转录 PCR 过程；同时，在该设计中，芯片的微通道在不同位置处开设出口，使得该芯片PCR循环次数能够在20、25、30、35、40之间选择。该设计方案极大地提高了微流控型 PCR 芯片的应用范围，使其不必拘泥于过于死板的循环次数的限制。Chiou等[27]、Frey等[6]分别报道了一种往复式通道，通过对流体的双向驱动系统，控制混合试样在不同恒温区之间来回反复流动而实现PCR扩增，这样既减少了通道长度，节省了空间，又控制了循环次数。

连续流PCR芯片在驱动力方面，很多研究者[28-31]报道一种使用不同温区下的温差所产生的对流浮力（Buoyancy force）进行管内反应液驱动的方法，并利用此原理制作出了快速，便携的微流控PCR扩增装置，成功进行了DNA的扩增。但是对流浮力驱动的芯片，对摆放位置要求较高[1]，且扩增效率有待进一步研究[29]。

对于上述类型连续流PCR芯片，微通道中只有单相的反应混合液流动，连续进行多种样本扩增时将会造成样本相互污染、管壁吸附、蒸发和扩散稀释[32]。刘金华[33]设计一种螺旋式连续流PCR芯片实现了样品间无交叉污染，但仍需进行微通道洗涤。近年来，基于液滴微流体技术的液滴型微 PCR 芯片克服了这些不足。Wang等[34]首先报道了这种液滴型PCR芯片装置，该装置用注射泵驱动PCR反应液滴在95℃、72℃、55℃三个温区间往复运动实现扩增。Bu等[35]采用数值模拟研究了芯片热循环性能和压电泵的驱动特性，结果表明基于液滴的微PCR芯片具有非常好的升降温性能。Wang等[32]对液滴微流控PCR芯片的发展和优缺点进行了总结，展示了一种纳米级液滴微流控PCR芯片，研究了反应液浓度、在一温区停留时间和模版量对液滴PCR的影响，提供了这种液滴微流控系统的详细信息和在优化系统结构了操作方面的参数。

3 微流控PCR芯片在法医DNA检验中的应用及展望

3.1 DNA定量

DNA定量在法医DNA检验中是必要的步骤，其主要目的确定要扩增的DNA的量。DNA混有抑制剂或高度降解或量太少都可导致PCR扩增失败。因此，这就需要精确地测验DNA模板的数量和质量，定量必须只针对人类DNA且要灵敏[36]。在芯片上直接进行法医DNA定量需要用实时PCR(real time PCR,RT-PCR)或定量PCR(quantitative PCR, qPCR)。

Horsman等[36]综述了利用微流控PCR芯片进行DNA定量检测的几种方法，分别是Taqman荧光探针法（Northrup等，1998；Liu等，2002）、SYBR荧光染料法（Lin等，2002）和电化学方法（Lee等，2003）。他指出这些方法虽然对DNA定量是有效的，但都集成了加热器和温感器等，做成一次性适用的芯片成本比较大，而一次性适用在法医检验中是很重要的。

2011年Yu[37]等展示了一种用于DNA定量的微流控装置。采用外置的红外线加热方法和SYBR荧光染料，结合适当的滤镜，把红外线对荧光背景的影响降到最低，使整个热循环过程中产生的荧光信号都被检测到，成功对实现DNA的定量。这种装置采用非接触式红外加热，降低了芯片的制作成本，便于芯片的一次性适用，也有利与和PCR前的样本提取、纯化及PCR后的电泳检测集成。

要利用微流控技术进行准确有效的DNA定量，还有许多工作要做，很多方法正处于发展阶段，目前的微qPCR已经可以满足法医DNA检验的需要，但在实际法医DNA样本分析中应用的报道还很少。传统的qPCR方法可以同时进行男性/总DNA定量或基因组/线粒体DNA定量，这完全可以扩展到微流控装置上进行[36]。

3.2 短串联重复序列（short tandem repeats，STR）复合扩增

在过去的20年中，STR分型已成为被普遍接受的进行个体识别的金标准[38]在微流控PCR芯片上进行STR位点的复合扩增已经成为现实。Lagally等[39-40]和Waters等[41]完成了牙釉原蛋白基因（amelogenin）片段的扩增。Legendre等[42]用AmpFlSTR®、COfilerTM和ProfilerTM试剂盒在芯片上实现STR片段的扩增。Schmidt等[43]用PowerPlex16扩增试剂盒在芯片上实现1μl体系扩增。Legendre等[42]报道的STR位点复合扩增体系只有200nL，热循环在100min内完成。

传统的整个DNA STR分析过程需要8-10小时，其主要原因是PCR过程耗时过长（大于3小时）[44]。在法医实际中，往往需要对DNA进行现场快速分析，这也一直是法医工作者们的共同追求目标。研究者们在这方面做了很多工作。Liu等[45]扩增9个STR位点用时45min。Hagan[46]等用红外线加热的方法，在45min内扩增16个STR位点，得到这些位点的完整分型结果。

而在性侵害案件中，往往也需要做Y染色体的STR分型。Liu等[47]设计了种便携式PCR-CE装置，在1.5小时内实现对釉原蛋白（amelogenin）基因座和3个Y-STR基因座（DYS390, DYS393, DYS439）的复合扩增及电泳分离。并对实际案件中的检材（口腔试子和人骨骼）进行扩增，4个位点全部成功扩出。

上述报道的微流控PCR芯片技术的应用，都集成了样品DNA的提取、纯化或（和）电泳检测功能，这使得样品的处理更加自动化，减少了人为操作造成污染的可能。Bienvenue等[48]成功制作了集成样本DNA的固相提取和PCR-STR位点复合扩增的芯片，实现对复杂生物样本（全血和精斑）DNA的提取和扩增，但加热和对PCR产物的电泳分析都是依赖传统的方式。最近，Liu等[45]展示了种新的集成微流控系统，用探针进行序列特异性DNA纯化后，在线注入PCR-CE微系统，在PCR后对反应腔进行清洗，并用这种系统对来自口腔试子样本的DNA完成了快速STR分型。

目前，虽然在微流控PCR芯片上进行STR位点的复合扩增已经得到很大的发展，但位点丢失的问题还没有得到有效的解决，这需要进一步优化用于这种芯片STR复合扩增的扩增试剂，达到甚至超过传统的标准，可以用于不同种类的样本（如各种液体、斑痕样本，降解或（和）含有抑制剂的样本，低拷贝数样本等）。当完全发展起来时,微流控PCR技术无疑能很大程度地减少法医DNA检验的时间和成本。

3.3 展望

在过去的十年多中，微流控PCR芯片技术快速发展。理想的PCR是在低体积的反应体系下实现快速有效的扩增。与传统的PCR仪相比，微流控PCR芯片实现了低体积扩增，但随后是否要降低反应体系中DNA的量还没有进行充分的论证。每种PCR扩增方式都有自身的优点和不足，要真正实现低成本、低体积、高速度和高效率可能还需要一定的时间。这些目标实现时，将会真正发挥出微流控PCR芯片的优势。

在法医DNA检验分析中，微流控PCR芯片已开始崭露头角。法医学家们可以根据实际的需要，设计制作单模（仅用于PCR扩增）的微装置和全集成（集DNA提取、纯化、扩增和分离检测于一体）的微装置。单模的更易实现高通量，在成批次地处理大量待检DNA样本方面有优势，而全集成的微装置更适合现场分析和需要快速出结果的重要案件。目前已有用这些装置在实际案件中进行快速现场分析中试用[45]，但还没有大规模投入使用。随着微流控技术的发展和应用，将改变现有的DNA检验方法，利用微流控分析技术进行现场快速、高效地处理案件。

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