如何更好的开展中学生物的PCR实验

杨青青

（北京教育学院，北京 100044）

引言

聚合酶链式反应(Potymerase Chain Reaetion,PCR)技术自1985年问世以来，以其操作简便、特异性强、灵敏度高、结果快速准确等特点迅速进入生命科学研究、临床疾病诊断、法医鉴定、考古学、农业科学、食品研究、环境保护等领域，从某种意义上可以说二十一世纪是"分子生物学世纪"。作为高校经典分子生物学技术的PCR技术已经悄悄的进入中学生物的课本中并且占有一席之地。对于中学生，PCR实验的难度无疑很大，一线教师往往会觉得PCR实验涉及的理论知识背景繁杂，操作过程多，实验结果不理想，主要巴克扩增片段的特异性不强以及产物产量低等问题。本文正是针对以上问题，立足于为改善PCR实验效果提供几点个人思考。

1 聚合酶链式反应的原理

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成：

① 模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

② 模板DNA与引物的退火(复性)：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配 对结合；

③ 引物的延伸：

DNA模板——引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的"半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

2 PCR实验成功的关键点介绍

2.1 引物设计的注意事项

引物的质量是保证PCR特异性的关键，引物过长或过短均会使特异性降低，以18～30bp为宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物内部和引物之间不应含有互补序列；引物的碱基顺序与非扩增区域的同源性应小于70%；引物的3’末端与模板DNA一定要配对，但末端没有严格的限制，故引物设计时可在5’末端加上限制性内切酶位点和/或启动密码ATG等；引物合成后必须纯化以去除合成产物中的不完整序列、脱嘌呤产物、碱基修饰链等“杂质”；引物的终浓度一般为0.2～0.5μmol/L，过低会影响反应产量，过高会增加引物二聚或错配的几率。现在引物设计越来越多的借助于相关的专业设计软件，更快更准确的设计出实验人员所需要的引物。

2.2 PCR反应体系的优化

2.2.1 高保真DNA聚合酶的选择

Taq DNA聚合酶具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性，但无3’-5’外切酶活性，因此对单核苷酸的错配无校正功能，发生碱基错配的几率为 2.1×10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的优势在于反应产量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人员心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶经基因工程改造后，新创出的Pfu Ultra具有更佳的校验活力。数据显示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均错配率为Pfu DNA聚合酶的1/3，为Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶(保真度＝1/错误率)。

2.2.2 盐离子浓度控制

Mg2+浓度也是影响反应效率和特异性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶对Mg2+浓度非常敏感，Mg2+可与模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根结合，不同反应体系中应适当调整MgCl2的浓度，一般以比 dNTP总浓度高出0.5～1.0mmol/L为宜，Mg2+过量能增加非特异扩增。

2.2.3 dNTP浓度的控制

dNTP的浓度过高会增加碱基的错误掺入率，使反应特异性下降；过低则会导致反应速度下降。使用时4种dNTP必须以等当量浓度配制，均衡的dNTP有利于减少错配误差和提高使用效率。

2.3 Tm值的合理选择

温度循环参数中应特别注意复性温度，它决定引物与模板的特异性结合。退火复性温度可根据引物的长度，通过Tm＝4(G+C)+2(A+T) 计算得到。在Tm允许的范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物与模板之间的非特异结合。

2.4 PCR实验结果污染的防治

减低污染的常规措施：①将PCR试剂、PCR产物及其他分子生物学试剂分开放置；②应保持样品制备、PCR反应液配制与PCR产物分析三个工作区的独立性；③使用阳性和阴性对照；④使用最高质量的水配制PCR实验的所有反应试剂；⑤配制好的PCR反应试剂应分成小包装储存，每个包装仅用于单次实验；⑥制备样品、配制试剂及反应液时必须戴手套；⑦实验前一定要认真清洁加样器等。

3 实验结果的检测

一般为48 h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。每次实验，都要认真设计好对照试验，包括阳性对照和阴性对照。PCR扩增DNA片段只是一个重要手段，扩增片段的检测和分析才是目的，根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。琼脂糖凝胶电泳可鉴定扩增产物的大小；点杂交技术除可鉴定扩增产物外，还有助于产物的分型；Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小，增加检测的特异性与敏感性；电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。最近发展的一系列产物分析法(PCRELISA、PCR-EIA、PCR-OLA等)均有助于PCR产物的精确分析。在对PCR实验结果检测的时候往往会用到核酸特异染料，常见的是EB（溴化乙锭）。该染料灵敏度较高，是应用最广的核酸染料，但同时存在安全隐患，因其插入核酸能导致其变异，所以在实验过程中一定要注意佩戴好手套及相应的防护措施，这一点在开展学生实验时尤为重要。

4 常见问题讨论

变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。可能由于引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体，也可能是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。所以必要时重新设计引物，减低酶量或调换另一来源的酶，降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起的。

5 中学PCR实验室的建设

PCR实验室的建立，是生物课开设分子生物学实验的必备条件，是依据学生的兴趣和需要,在教师的指导下有目的、有计划、有组织地通过多项活动项目和活动方式使学生获得直接经验和最新信息以及实践能力的基础。它对提高学生素质,促进学生个性的充分发展,提高各种能力,具有独特的功能,对素质教育的贯彻和落实有极大的带头和示范作用。

（1）加深学生对课本知识的理解。分子生物学实验课能增加学生动手的机会,使学生在动手做实验的过程中更加深刻地理解理论知识,通过简单易懂的实验来加深学生对抽象理论的理解,使原来枯燥乏味的分子生物学变得生动有趣,学生学习的兴趣也明显增加。同时掌握基本的分子生物学技术,适应未来社会发展对人才的需求。

（2）提高学生的积极性和主动性，有利于培养学生的兴趣、爱好、特长,更利于培养学生的创造力。由于生物技术的内容丰富,形式多样,比较符合中学生的特点。强烈的好奇心和旺盛的求知欲又是推动人进行创造思维的内部动力,是创造能力培养的前提和关键。例如“亲子鉴定实验”、“染色体分型实验”，可以引发学生独立思考、探究实践的真谛。

（3）能够开阔学生视野,提高素质教育,充分发展学生综合能力。在实验中让学生去参与实验设计、亲自动手，获得直接经验。使学生加深理解和巩固课堂上所学知识，提高多种能力，接受科学方法、科学思维的训练。让学生从小养成严谨求实的科学态度，发展创造思维，形成创造品格，增长创造才干。如组织学生检测转基因食品标本，再如针对不同样本的DNA提取和分离“实验步骤多、难度大”的特点，可以组织学生从不同角度设计改进实验……。通过各种活动的训练，培养学生独立进行科学实验的能力，也培养了他们勇于战胜困难的科学精神。

（4）利于培养学生主体意识和自我教育能力。实验中学生始终处于主体地位：学生主动参与实验课题提出、方案设计、实施操作，总结、讨论、撰写论文等全部过程。学生在实验中学习、掌握、运用知识，真正成为学习的主体；在活动中最大限度地发挥学生主观能动作用，进行自我组织和评价,培养自己实事求是的科学态度、不断探求新知的精神。

（5）提高生物教学的总体水平、突出生物教学的重要性。多年来由于受应试教育的影响，学校不重视生物课实验，学生不愿意学，教师有情绪，高等师范学校生物专业受冷落，是造成生物教学薄弱的根本原因。因此，分子生物学实验的开设，能够提高教师的综合素质，激发教师的积极性，提高了教学水平。

6 展望

PCR是分子生物学的关键技术，又是常规技术。它的出现极大地推动了分子生物学的发展，即被迅速推广并应用到生命科学的各个领域。本文核心在于解决中学阶段PCR实验教学过程中遇到的几类棘手问题，目的在于通过总结PCR实验的成功核心要素，便于教师和学生在今后的实验过程中能将该实验的教学效果加以改善，同时培养学生探究能力和分析解决问题的能力，更重要是搭建中学实验与高等学府科研的桥梁，让学生在以后的研究道路中走得更稳更实。