快速检测方法在食品微生物检测中的应用研究

孟 甜

（四川烹饪高等专科学校，四川 成都610100）

食品是人类赖以生存的物质基础，其安全性直接关系到人类健康。微生物是影响食品安全最重要因素之一，食品中微生物种类、数量不仅决定食品货架期，也是评价食品安全性的主要指标[1]。食品法典委员会（CAC）将微生物性健康危害列为食源性危害的三大原因之一。特别是近年来，可导致人类感染的致病菌种类越来越多，病原微生物对人类的威胁越来越大[2]。如何快速、高效、准确的检测和评价食品中的微生物是全球研究的热门问题。

1 传统检测方法

1.1 琼脂平板培养法

1881年，Robertkoch首次引入琼脂平板培养法用以检测微生物[3]。后来随着食品对微生物的要求，该法逐渐用于快速检测微生物。

1.1.1 选择性培养基检测法

选择性培养基是利用目的微生物对各种化学物质敏感程度的差异，在培养基中加入选择性抑制剂，用以抑制非目的微生物生长，使目的微生物生长的培养基。

啤酒企业所处环境不同其污染菌群不同，检测啤酒污染菌使用的培养基也不同。使用NPS培养基可以较为准确的检测出啤酒中厌氧有害微生物的数量(主要为乳酸菌)。若样品污染较为严重，使用NBB-A培养基也可比较准确的检测出结果。这两种培养基因加入了啤酒酵母抑制剂，生产用酵母不能在其上面生长[4]。

1.1.2 显色培养基检测法

用显色培养基快速鉴定微生物是一种相对较新的方法，该技术以生化反应为基础，通过在培养基中加入细菌特异性酶的显色底物直接根据菌落颜色对菌种作出鉴定，常用于食源性致病菌检测[5]。如李斯特菌是一类个体较小的革兰氏阳性杆菌，其中只有单增李斯特菌和绵羊李斯特菌具有致病性。近年来，许多国家致力于李斯特菌显色培养基的研究，针对李斯特菌特有的肌醇磷酸磷脂酶和β-D葡萄糖苷酶设计显色底物可对李斯特菌进行快速检测。

但显色培养基检测法也有一定缺陷，如检测混合感染微生物时，常会造成目标菌漏检和检测结果假阴性；对检测结果不能定量分析等。

1.2 显微镜镜检法

显微镜镜检法是较常规的检测法，一般观察微生物形态和定量检测。主要步骤是：（1）样品的处理：使用显微镜检测样品中的微生物浓度要高，因此对于一般样品而言，要先富集后镜检。（2）镜检：在洁净的载玻片上滴一滴准备好的菌液，盖上盖玻片，再滴一滴香柏油，使用油镜检测。

2 现代检测方法

由于传统的快速检测方法存在诸多问题，为了能快速、方便、正确地检验食品微生物，近年来许多国家对此进行研究，并取得了进展，与传统方法相比现代检测方法更快、更方便、更灵敏[6]。

2.1 气相色谱法

气相色谱法是英国生物化学家诺贝尔奖金获得者A.J.P.Martin等人1952年创立的一种新型分离分析方法。该法应用于微生物检测大约开始于20世纪50年代末，1963年Able等首次通过细胞脂肪酸的分析来进行细菌分类，几乎时Oyama 等又提出用裂解气相色谱法鉴定细菌[7]。

将微生物细胞经过水解、甲醇分解提取以及硅烷化、甲基化等衍生化处理后，使之分离尽可能多的化学组分供气相色谱仪进行分析[8]。不同的微生物所得到的色谱图中，通常大多数峰是共性的，只有少数峰具有特征性，可被用来进行微生物鉴定，分析检测常见细菌、酵母菌、霉菌等。

2.2 免疫学检测方法

2.2.1 酶免疫检测法

酶免疫检测法（EIA）可根据抗原抗体反应是否需要分离结合和游离的酶标记物分为均相和非均相两种类型。非均相法较常用，包括液相免疫法与固相免疫法。固相免疫法的代表技术是酶联免疫吸附技术（ELISA）[9]。

ELISA技术自20世纪70年代出现开始就成为检验中应用最为广泛的方法之一。它是将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后，通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量。

ELISA技术具有可定量、反应灵敏准确、标记物稳定、用范围宽、结果判断客观、简便完全、检测速度快以及费用低等特点，且同时可进行上千份样品的分析。

2.2.2 免疫层析技术

免疫层析（IC）是20世纪80年代初发展起来的快速免疫分析技术，它将免疫学原理和层析原理结合，借助毛细管作用，样品在条状纤维制成的膜上泳动，其中的待测物与膜上一定区域的配体结合，通过酶促显色反应或直接使用着色标记物，在短时间（20min内）便可得到直观结果。利用免疫层析原理开发出的各种食品微生物检测试纸条具有很好的应用价值。

2.2.3 免疫磁珠分离法

免疫磁珠分离法（IMS）是将磁性微球与免疫化学技术结合起来的方法。该方法是先用抗体包被的磁珠与样品混合，再用一个磁场装置收集磁珠。

该方法可快速的从食品成分中分离出靶细菌，克服了选择性培养基的抑制作用问题。有报道称用免疫磁性分离技术从乳及乳制品、肉类和蔬菜中分离出沙门氏菌。

2.2.4 免疫荧光法

免疫荧光法（IFT）是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。

免疫荧光法主要有直接法和间接法。目前免疫荧光技术可用于沙门氏菌、李斯特菌、葡萄球菌毒素和单核细胞增生李斯特氏菌等的快速检测。该技术的主要特点有特异性强、敏感性高速度快。

2.2.5 乳胶凝集试验

乳胶凝集试验（LAT）是用人工大分子乳胶颗粒标记抗体，使之与待测抗原发生肉眼可见的凝集反应，以达到检测目标病原微生物或毒素的目的。如用于检测食品中金黄色葡萄球菌的Aureus Tes试剂盒，该试剂的聚苯乙烯乳胶粒子中含有抗金黄色葡萄球菌A蛋白的IgG，当含有金黄色葡萄球菌的样品悬浮液加入含乳胶粒子的试剂后，A蛋白与IgG结合，凝聚酶和鞭毛抗原结合，lmin内将产生凝聚反应。

2.2.6 酶联荧光免疫法

酶联荧光免疫法（ELFIA）是在酶联免疫吸附分析基础上发展起来的一种检测方法。将酶系统与荧光免疫分析结合起来，在普通酶免疫分析的基础上用理想的荧光底物代替生色底物，可提高分析的灵敏度和增宽测量范围，减少试剂的用量。

目前，将酶放大技术、固相分离及荧光检测三者联合将会成为荧光免疫分析中最灵敏的方法。

2.2.7 免疫印迹法

免疫印迹（immunoblotting）法分三个步骤：第一，聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将蛋白质抗原按分子大小和所带电荷的不同分成不同的区带。第二，电转移，将凝胶中己分离的条带转移至硝酸纤维素膜上。第三，酶免疫定位，将前两步中已分离，但肉眼不能见到的抗原带显示出来。

免疫印迹法综合了SDS-PAGE的高分辨率及ELISA的高敏感性和高特异性，是一种有效的分析手段广泛应用于酵母和真菌的检测中。

2.3 传感器检测法

2.3.1 基因传感器

基因传感器是把已知核苷酸序列的半单链DNA分子固定在传感器上（也称ssDNA探针）和另一条互补ssDNA（目标DNA）杂交，形成双链DNA（dsDNA）后表现出一定的物理信号，再通过换能器反映出来。基因传感器使对目的DNA测量时间大大缩短，且操作简单、灵敏度高。

目前，基因传感器主要有石英晶体振荡器、光学式DNA传感器等。Uramatsu等采用抗体压电晶体生物传感器测定大肠杆菌，检测细菌下限为105个/mL。

2.3.2 生物传感器

生物传感器基本原理是通过被测分子与固定在生物接受器上的敏感材料发生特异性结合，并发生生物化学反应，产生热焓、离子强度、pH、颜色或质量等变化信号，且反应产生的信号强弱在一定条件下与特异性结合的被测分子含量存在一定数学关系，这些信号经换能器转变成电信号后被放大测定，从而间接测定被测分子的量[10]。它的特点是高特异性和高灵敏度。

有试验已成功表明，采用光纤传感器与聚合酶链式反应生物放大作用耦合，可实现对食品中李斯特菌单细胞基因的检测，而采用酶免疫电流型生物传感器可实现对存在于食品中少量的沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等的检测。

2.4 分子生物学检测法

2.4.1 PCR技术

PCR是l985年由美国Kary Mullis等人首创并由美国Cetus公司开发的一项体外扩增DNA的方法[11]。利用PCR检测细菌，以快速、灵敏的检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，尤其是那些人工无法培养的细菌。

该方法已经对乳酸菌、双歧杆菌等进行了精确的检测和鉴定。用于检测啤酒中淀粉酵母和啤酒酵母、水体中大肠杆菌和大肠菌群。另外，肉毒梭菌、沙门氏菌、变形弧菌、大肠杆等病菌都有用PCR方法检测的报道。但是PCR技术的使用也有局限性，仅限于那些核酸序列已知的微生物的鉴定。

2.4.2 基因芯片

将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增后，制备荧光标记探针，然后再与芯片上的寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。

Appelbaum在对几种细菌进行鉴别时，设计了一种鉴别诊断芯片，一方面从高度保守基因序列出发，即以各菌种间的差异序列为靶基因，另一方面选择同种细菌不同血清型所特有的标志基因为靶基因，固着于芯片表面，同时还含有细菌所共有的l6SrDNA保守序列以确定为细菌感染标志，不仅敏感度高于传统方法，且操作简单，重复性好。

2.5 自动检测法

美国麦道保健系统公司制造了称作Vitek AMS的微生物自动检测系统，该装置最大特点在于无须经过微生物分离培养和纯化的过程，能直接从样品中检出特殊的微生物种类和菌群。麦道公司在原有Viteck AMS的基础上，又推出第二代检测系统，即Viteck免疫诊断检测系统(ⅥDAS)。它是集固相吸附，酶联免疫，荧光检测和乳胶凝集试验诸方法优点于一体的综合性检测系统[12]。

2.6 抗阻测定法

在含有几种不同底物的培养基上，分别接种适量的被检微生物，经培养后可用阻抗测量仪在检测其生长情况的同时也表达出特征进而鉴别其种、属。此法广泛用于细菌、酵母菌、霉菌和支原体等的检测和鉴定，具有高敏感性、特异性、快反应性和高度重复性等优点。

2.7 “即用胶”测定法

“即用胶”测定法是把lml食物样品倾入一盛有无菌液体培养基的试管中，混匀后再将混合物倒入一个装有胶质的特殊培养皿中。混合物与胶质接触后便形成琼脂相似的复合物，经培养后便可计数菌种及数量。该系统是包装好的产品，用时不需灭菌，极适合野外测定。

2.8 自动旋转平板测数法

通过螺旋制板机将0.035mL液态样品以阿基米德螺线的形式接种在琼脂平板上，输样量随着输液管从平板中心向边缘的移动而减少。经过培养后，将平板放在计数格上，此格划分成一些已知面积的区间，菌落数即在此区间内计数。此法已被AOAC推荐为法定方法，在美国广泛采用[13]。

3 小结

随着新型设备的使用如毛细管电泳法、质谱法[14]，新型设备的联用，如气相色谱-原子吸收联用，及新型方法的联用如RT-PCR技术，不但能够检测到活性较强的细菌，而且还能够检测到处于VBNC状态下的细菌，具有较强区分死活菌的能力，检测结果可作为菌体活性评估的重要参照，这是其它快速检测法以及传统检测法均无法比拟的优势[15]，将来的食品微生物检测将更加快速、灵敏、简便。

食品安全问题一直是引起人们广泛关注的全球性问题之一，长期以来，科学家们都在寻求简单、快捷、准确的快速检测方法，从传统烦琐费时的琼脂平板培养法到现代方便、灵敏的各种免疫法、分子生物学及仪器联用等方法，虽然有些技术方法还存在不完善、不足的地方，但是各国的专家都在致力于改善或寻求更加科学、更加完善的快速检测技术[16]，相信随着科学技术的不断进步有更多新的技术和方法不断涌现。不久将来食品微生物检测技术一定能更好的服务于人类！

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