猪繁殖与呼吸综合征病毒反向遗传技术的研究进展

邓雨修，王东东，潘永飞，周庆丰，苏润环，李春梅

（广东温氏集团研究院，广东 新兴 527400）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）诱发的急性接触性传染病，主要引起妊娠母猪的繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状。PRRS的病原具有遗传多样性，在世界上流行广，防控难度大，所造成的经济损失严重。猪繁殖与呼吸综合征病毒属于RNA病毒,利用反向遗传学技术可以为其致病机制研究和新型疫苗的研制提供有效的技术平台。以下主要从反向遗传学技术在病毒基因功能研究中的应用及减毒活疫苗株拯救等方面进行阐述。

1 反向遗传技术在PRRS病毒研究中的应用

PRRSV作为正链RNA病毒家族的一员，其基因组同时也作为mRNA，并具有感染性。直接将编码病毒基因组的cDNA克隆转染，或将体外由cDNA克隆转录出的病毒RNA转染易感细胞就可以获得完整的有感染性的病毒。因此反向遗传学在PRRSV的研究中应用较广，已渗透到了PRRSV研究的各个方面。

1.1 反向遗传技术在PRRSV基因组结构和功能研究中的应用 随着拯救技术的成熟，越来越多的研究者开始利用反向遗传技术通过缺失、突变等操作对PRRSV的基因功能进行研究。Ansari IH等通过对GP5第34、44位和51位几个糖基化位点进行突变，然后拯救后发现，第44位突变后不能得到活病毒，而第34和51位突变后的拯救病毒滴度要低于母病毒。接种猪后发现，突变后的病毒可以产生较高的中和抗体。Han J等通过对nsp2进行一系列的缺失操作后发现，nsp2的13～35位氨基酸是病毒复制的非必需区，高变区（324～813）可以承受100个或200个氨基酸的缺失，但是在324～726位不能全部缺失，最多容忍400个氨基酸的缺失。袁世山等对PRRSV的3′UTR进行了一系列的缺失、插入后发现，UTR区的5′端可以承受41个核苷酸的缺失和23个核苷酸的插入，并且发现，此区域保守的茎环结构区微小的改变便会破坏病毒的感染性。

Zhou Lei等构建了4个PRRSV全长cDNA感染性克隆，然后拯救出的相应毒株都能在MARC-145细胞中稳定复制，并且在SPF猪中检测了上述拯救PRRSV的毒力，试验表明30位氨基酸的缺失对中国流行的高致病性PRRSV的毒力没有影响。Kwon B等对FL12基因组的不同位置进行了一系列突变，得到了不同的拯救病毒，发现nsp3～8以及ORF5上存在主要的潜在毒力位点；同时，nsp1～3、10～12以及ORF2上也可能有潜在的毒力位点。Chen Z等通过对nsp2上的B细胞表位进行缺失操作，发现这些区域对于PRRSV的复制并不必要，但对于调节宿主的免疫反应有着重要的作用。Kim等利用反向遗传技术通过插入与缺失nsp2区域的有关序列，重构病毒，并对PRRSV的基因、氨基酸与其免疫原性和毒力的相互关系进行了深入探索，说明该技术在PRRSV中的应用已经达到了很高水平。

1.2 反向遗传技术在PRRSV疫苗研究中的应用 在研制PRRS减毒活疫苗方面，与传统的连续细胞传代弱化毒株的方法相比，反向遗传技术可以很容易地根据不同的流行毒株而改变相对应的保护性抗原，并且具有减毒途径明确、效率高、毒力回复率低等优点。Fang Y等通过将nsp2编码区的编码抗原决定簇ES4基因敲除，换以编码绿色荧光蛋白（GFP）基因，得到了表达nsp2-GFP融合蛋白的PRRSV，动物试验表明该重组病毒可以在血清学上和野毒株区分开来，为以后标记疫苗的研制提供了依据。Tan F等在N蛋白中发现了一些区域，这些区域的缺失并不影响PRRSV在细胞中的活力，这些区域还可以作为外源tag等插入，而成为标记疫苗的候选。Lima M等通过去除特定的免疫显性表位，得到了一系列毒株，进一步为标记疫苗的研制提供了证据。Wang Y等通过将强毒株MN184的结构蛋白部分和弱毒疫苗Ingelvac PRRS MLV的非结构蛋白进行嵌合，将MN184进行了致弱，提供了一种全新的、简便的制备弱毒疫苗的思路。Pei Y等利用PRRSV的TRS序列，在P129中插入了GFP和PCV2的衣壳蛋白基因，同样都得到了表达，表明PRRSV亦可以作为疫苗载体应用于猪疫病防治之中。

2 结语

反向遗传学技术为研究PRRSV开辟了新途径，利用该技术可以了解病毒生命活动过程中的各种调控机制,可以很容易地对病毒的复制及致病性分子机理进行研究，从而开发出相应的疫苗或药物。反向遗传操作技术最具潜力、最吸引人的应用在于对新型疫苗株的筛选，其优越性一方面在于可以解决疫苗研制的时效问题，另一方面可以通过体外基因修饰的方式，将决定毒力的基因敲除，同时又可引入分子标记以研制标记疫苗。时至今日，PRRSV与宿主的相互作用、致病机制及基因变异与重组机制等仍是研究热点。而反向遗传技术作为一种十分有效的研究工具，由于其自身所固有的优点，在未来的PRRSV研究中必将发挥出积极的作用。

参与文献：

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[4] Fang Y，Christopher-Hennings J，Brown E，et al.Development of genetic markers in the non-structural protein 2 region of a US type 1 porcine reproductive and respiratory syndrome virus:implications for future recombinant marker vaccine development[J].J Gen Virol，2008 Dec；89（Pt12）：3086-3096.

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[7] Pei Y，Hodgins D C，Wu J.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus as a vector:immunogenicity ofgreen fluorescent protein and porcinecircovirus type 2 capsid expressed from dedicated subgenomic RNAs[J].Virology，2009 Jun 20；389（1-2）：91-99.