膀胱移行细胞癌组织中p57kip2mRNA表达变化

葛 雷，曲晓伟，胡建庭，单中杰，韩前河，杨庆祥，翟晓磊，赵 阳

(郑州人民医院，郑州450003)

膀胱癌是泌尿系统最为常见的恶性肿瘤，尤以移行细胞癌为多见，其发病机制仍不十分明确［1］。有研究表明细胞周期分布的改变与细胞癌变密切相关，许多癌基因、抑癌基因参与了细胞周期的调控。p57kip2作为候选抑癌基因，其表达与大肠癌、上皮性卵巢癌、肝癌、甲状腺癌、肝外胆管癌及肝内胆管癌等发病机制关系密切［2］，而与膀胱癌的关系报道仍较少。2011年8月～2012年4月，我们检测并比较了26例膀胱移行细胞癌组织和19例癌旁正常组织中的p57kip2mRNA。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集郑州人民医院26例原发性膀胱移行细胞癌患者手术切除的新鲜组织标本，为观察组。26例患者中男18例，女8例;年龄28～78岁，平均62.6岁。在遴选病例时将有酗酒和过量吸烟(＞20支/d)等不良嗜好者及化工制造从事业者等膀胱癌高危人群剔除。另取19例癌旁正常组织标本为对照组。

1.2 p57kip2mRNA检测方法 将组织研碎，按50～100 mg/mL标准加入Trizol，冰上放置5 min;然后加入200 μL氯仿，快速震荡15 s，冰上放置10 min后，4℃、15 000 r/min离心15 min;仔细吸取上层水相，移至另一支EP管中;加入等体积(约500 μL)异丙醇，冰上放置10 min;4℃、15 000 r/min离心15 min，弃上清，加入75%乙醇(焦碳酸二乙酯处理灭菌水配制)500 μL，充分洗涤沉淀物;4℃、10 000 r/min离心5 min后弃上清，室温干燥3 min，DEPC处理灭菌纯水20 mL溶解RNA沉淀;分光光度计测定总RNA产物量及纯度，提取的RNA置于－80℃冰箱冻存。参照文献设计引物［1，2］。PCR反应条件: 95℃变性5 min，然后按95℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃60 s，进行35个循环，最后72℃延伸10 min。

制备2%的琼脂糖凝胶，含溴化乙锭0.5 μg/ mL。取PCR扩增产物5 μL与上样缓冲液1 μL混匀，加入加样孔。电泳缓冲液为0.5×TBE。电泳条件为80 V电压，45 min。在β-actin同时扩增出来的前提下，扩增产物在紫外灯下呈明亮的橙色荧光，其所处的位置与该目的基因片段长度相符，即为阳性。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。组间比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

观察组26例(38.45%)、对照组19例(100%) p57kip2mRNA表达阳性，两组p57kip2mRNA阳性表达率相比，P＜0.05。

3 讨论

膀胱癌在我国泌尿系统恶性肿瘤中占首位，以移行细胞癌为主。尽管人们已经对膀胱癌的病因、病理、诊断和治疗等进行了深入的研究，但其发病机制仍不十分明确。膀胱癌的发生是一个多因素、多步骤、复杂的渐进过程，其病程的发展和演进也同样涉及多个抑癌基因的失活和(或)癌基因的激活。研究表明细胞周期与细胞癌变密切相关，许多癌基因、抑癌基因参与了细胞周期的调控，或者其本身就是细胞周期的组成部分，它们的改变导致了细胞周期的失控，表现为细胞的失控性生长，

p57kip2基因定位于染色体 11p15.5上的D11S648和Dl1S679之间约2.2 kb的区域内［3，4］，属CIP/KIP家族，与 p21、p27功能相似，通过与CDK结合而抑制CDK的功能使细胞周期停滞在G1期。Lee等［4］认为p57kip2作为候选抑癌基因，其抑癌机制可能是p57kip2蛋白与Cyclin-CDK复合物相结合，阻止细胞增殖，从而使细胞周期停滞在G1期。Kondo等［5］认为正常情况下，p57kip2基因为父源等位基因被印记，母源基因表达，在一些肿瘤中存在p57kip2基因印记缺失或印记错误，导致基因表达下降。关于p57kip2蛋白在肿瘤组织中表达的研究多集中在大肠癌、上皮性卵巢癌、肝癌、甲状腺癌、肝外胆管癌及肝内胆管癌等。而有关p57kip2表达与膀胱癌关系报道较少。Nakai等［6］研究发现，p57kip2蛋白的表达与肝细胞癌的病理组织阶段、分化程度及患者的预后有密切关系，且在中、低度分化的肝细胞癌中，p57kip2基因有明显的杂合性缺失，可认为p57kip2基因表达下降或缺失是肝细胞癌晚期的表现。Oya等［7］利用RT-PCR技术检测24例膀胱移行细胞癌和14个膀胱癌细胞株，发现其中p57kip2达显著下降，其中部分p57kip2表达缺失，说明p57kip2是一种在膀胱癌中影响母系染色体11p15.5的重要靶基因。本研究结果显示膀胱移行细胞癌组织中p57kip2的阳性表达率要明显低于癌旁正常组织，提示 p57kip2异常低表达与膀胱癌发病密切相关。理论上，作为一种细胞周期负性调控因子，应在正常组织中表达，而在肿瘤组织中会受到抑制而表达减少或表达缺失，导致细胞生长失控而恶变［8，9］。但是正性调控因子增加后，为达到细胞周期调控的平衡，可反馈性的引起负性调控因子的增高，直至肿瘤发生并恶化后这一平衡才被打破，负性调控因子的表达因而下降。

此外，本研究还发现p57kip2mRNA及蛋白表达与肿瘤的高临床分期和预后有极大关系，说明p57kip2基因的失活在膀胱癌的进展中起着一定的作用，并可能是一个新的预后指标，这与文献报道的一致［7～9］。关于 p57kip2基因在膀胱癌失活的具体机制，还需要进一步研究［10，11］。

［1］Tannapfel A，Busse C，Weinans L，et al.INK4a-ARF alterations and p53 mutations in hepatocellular carcinomas［J］.Oncogene，2001，20(48):7104-7109.

［2］Li Y，Nagai H，Ohno T，et al.Aberrant DNA methylation of p57 (KIP2)gene in the promoter region in lymphoid malignancies of B-cell phenotype［J］.Blood，2002，100(7):2572-2577.

［3］Matsuoka S，Edwards MC，Bai C，et al.p57kip2，a structurally distinct member of the p21CIP1 Cdk inhibitor family，is a candidate tumor suppressor gene［J］.Genes Dev，1995，9(6):650-662.

［4］Lee MH，Reynisdottir I，Massague J.Cloning of p57kip2，a cyclindependent kinase inhibitor with unique domain structure and tissue distribution［J］.Genes Dev，1995，9(6):639-649.

［5］Kondo M，Matsuka S，Vchida K，et al.Selective maternal allele loss in human lung cancers of the maternally expressed p57kip2gene at 11p15.5［J］.Oncogene，1996，12(6):1365-1368.

［6］Nakai S，Masaki T，Shiratori Y，et al.Expression of p57(KIP2) in hepatocellular carcinoma:relationship between tumor differentiation and patient survival［J］.Int J Oncol，2002，20(4):769-775.

［7］Oya M，Schulz WA.Decreased expression of p57(KIP2)mRNA in human bladder cancer［J］.Br J Cancer，2000，83(5):626-631.

［8］Shin JY，Kim HS，Lee KS，et al.Mutation and expression of the p27KIP1 and p57kip2genes in human gastric cancer［J］.Exp Mol Med，2000，32(2):79-83.

［9］Ito Y，Takeda T，Sakon M，et al.Expression of p57/Kip2 protein in hepatocellular carcinoma［J］.Oncology，2001，61(3):221-225.

［10］Uchida T，Kinoshita T，Ohno T，et al.Hypermethylation of p16INK4A gene promoter during the progression of plasma cell dyscrasia［J］.Leukemia，2001，15(1):157-165.

［11］Shin JY，Kim HS，Lee KS，et al.Mutation and expression of the p27KIP1 and p57KIP2 genes in human gastric cancer［J］.Exp Mol Med，2000，32(2):79-83.