肺炎衣原体诱发肺癌模型的建立

储德节 潘春峰 郭水根 王静 余竹元

（1.复旦大学附属金山医院呼吸内科，上海 201508；2.复旦大学附属中山医院，上海 200032）

近年来许多临床流行病学方面的研究表明，肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae，Cpn）慢性感染与肺癌的发生发展有关，Cpn感染已被确定为肺癌的危险因素［1］。但迄今为止，国内外尚无相关的动物实验研究的报道。本研究拟用Cpn感染这个单一因素复制肺癌大鼠模型，同时选用香烟中所含的公认致癌物苯并芘（Benzopyrene，Bp）与Cpn联合诱发大鼠肺癌，以期为进一步探讨肺癌的预防和研究Cpn感染在肺癌发生和发展中的作用，为肺癌提供新的治疗手段奠定基础。

1 资料与方法

1.1 Cpn菌株与实验动物

1.1.1 Cpn菌株TW－183购自美国标准生物品收藏中心（American type culture collection，ATCC），保存于－70℃，用前将菌株浓度调整为6×106IFU／mL。

1.1.2 Wistar大鼠购自上海市实验动物中心，体质量120～130g，雌雄各半，常规饲养7d后进行实验。

1.2 动物分组和实验方法 190只Wistar大鼠随机分为4组：Cpn组、Bp组、Cpn＋Bp组以及对照组。除对照组为40只大鼠外，其余每组50只。Cpn组：单独注入Cpn活菌株。方法为：用2%戊巴比妥钠（0.23mL／100g）腹腔注射麻醉大鼠后，将其固定于实验台上；轻拉舌，压迫舌腹部，暴露喉头；在解剖显微镜直视下插入塑料套管针，当针管外口有气流吹动棉花纤维时，则确定套管针插入气管内，然后向大鼠气管内注入100μL Cpn TW－183菌液（106IFU／mL）；注射完毕后立即将大鼠直立旋转并轻轻按压其胸部，以使菌液均匀分布于两肺部；每周注射1次，持续2个月。Bp组：单独注入Bp，操作参照罗素琼等［2］的方法。Cpn＋Bp组：Cpn与Bp联合注入。对照组不做任何处理。

1.3 检测方法

1.3.1 组织病理学检查 将大鼠处死后进行常规解剖，观察每组大鼠的肿瘤发生情况。记录肺癌的大体形态、瘤结颜色、硬度、炎症及坏死情况；对肺癌组织进行固定，切片，在显微镜下观察以明确病理诊断。

1.3.2 微 量 免 疫 荧 光 法 （microimmunofluorescence，MIF）检测血清中Cpn特异性抗体 血清学诊断标准：IgA、IgM 滴度≥1：32为阳性，IgG滴度≥1：64为阳性［3］。

1.3.3 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测肺癌组织中Cpn的DNA 引物序列为，HL－1：5’－GTT GTT CAT GAA GGC CTA CT－3’；HR－1：5’－TGC ATA ACC TAC GGT GTG TT－3’。产物大小为437bp。

1.3.4 酶联免疫吸附法检测肺癌组织中Cpn特异性抗原 切片厚度为6μm，按照常规方法检测。

1.4 统计学分析 计数资料用Stata软件行χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠生长情况 在试验过程中除对照组全部存活外，其他3组大鼠因麻醉意外、感染等原因均有死亡个体出现。3个月后实存大鼠为：Cpn组48只，Bp组46只，Cpn＋Bp组43只。每月测量各组大鼠的体质量1次，3个月后除对照组外的其余3组大鼠体质量显著增加，胸部有异物突出。第210天将各组存活的大鼠全部处死。

2.2 各组肺癌发生情况 对照组无大鼠发生肺癌，其余3组都有数目不等的大鼠发生肺癌。肺癌大小相差悬殊，大至300g，小的只有米粒大小。各组肺癌发生率及类型见表1。

表1 各组大鼠肺癌发生率

2.3 病理改变 3组大鼠的肺癌大小不一，肿瘤直径为0.1～5cm，呈灰白色，质地较硬，大结节中间可见有坏死。肺癌的典型标本及病理诊断结果见图1～4。

2.4 血清Cpn抗体检测结果 在Cpn组和Cpn＋Bp组的大鼠血清中可检测到Cpn的IgM、IgA和IgG，其中发生肺癌的大鼠血清中的IgA和IgG显著高于未发生肺癌的大鼠。Bp组大鼠血清中未检测到Cpn－抗体。结果见表2。

表2 各组大鼠Cpn感染率的比较及抗体的产生情况

2.5 PCR结果 PCR验证肺癌组织中存在Cpn，结果见图5。

图5 Cpn感染诱发肺癌的PCR结果

2.6 肺癌组织中Cpn抗原检测结果 Bp组大鼠肺癌组织均未检测到Cpn抗原；Cpn组和Cpn＋Bp组大鼠的肺癌组织中均可检测到Cpn抗原。

3 讨 论

Cpn是一种常见的人类呼吸道病原体。普通人群中Cpn的感染率很高，据Lin等［4］报道，台湾成年人血清中Cpn－IgG阳性率达45.5%。已有研究［5－9］表明，Cpn慢性感染与肺癌肺癌的发生有密切相关性，这些研究主要限于临床流行病学研究；但也有研究［10－12］持反对观点。为了更准确地评估两者之间的相关性，Zhan等［1］采用meta－方法分析了12项研究的结果，涉及2 595份肺癌病例和2 585份对照案例，最终将Cpn感染确定为肺癌的危险因素。

但是，迄今为止尚无关于Cpn感染诱发肺癌的动物模型的报道。本研究采用Cpn感染以及Cpn感染联合Bp的方法成功诱发肺癌大鼠模型。Cpn和Cpn＋Bp组Wistar鼠的Cpn感染率分别为72.9%和76.7%；2组的肺癌发生率分别为14.6%和44.2%，显著高于对照组。本研究中Cpn－抗体阳性大鼠的肺癌标本中可以检测到Cpn－DNA，且在Cpn组和Cpn＋Bp组大鼠肺癌组织中均可以检测到Cpn抗原，由此证明大鼠肺癌的发生与Cpn感染密切相关。Bp是香烟中的重要致癌物之一，本研究中Bp组的肺癌发生率为10.9%，显著高于对照组。Cpn组肺癌的发生率高于Bp组，但差异无统计学意义。Cpn＋Bp组肺癌的发生率显著高于Bp组。由此可见，Cpn慢性感染是肺癌的另一个独立危险因子。

Cpn慢性感染诱发肺癌大鼠模型的建立有望为肺癌的感染致病因素及防治开辟一条新途径。然而，Cpn慢性感染致肺癌的发病机制目前尚不清楚，仍有待于进一步研究。

［1］ Zhan P，Suo LJ，Qian Q，et al.Chlamydia pneumoniae infection and lung cancer risk：A meta－analysis［J］.Eur J Cancer，2011，47（5）：742－747.

［2］ 罗素琼，刘学泽，刘杰，等.青石棉，苯并芘联合诱发大鼠肺癌的研究［J］.华西医大学报，1995，26（2）：202－205.

［3］ Fan P，Dong F，Huang Y，et al.Chlamydia pneumoniae secrection of a proteases－like activity factor for degrading host cell transcription factor required for major histocompatibility complex antigen expression［J］.Infection Immunity，2002，70（1）：345－349.

［4］ Lin CY，Su SB，Chang CC，et al.The association between Chlamydia pneumoniae and metabolic syndrome in Taiwanese adults［J］.South Med J，2009，102（12）：1203－1208.

［5］ Chaturvedi AK，Gaydos CA，Agreda P，et al.Chlamydia pneumoniae infection and risk for lung cancer［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2010，19（6）：1498－1505.

［6］ Littman AJ，Jackson LA，Vaughan TL.Chlamydia pneumoniae and lung cancer：epidemiologic evidence［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，14（4）：773－778.

［7］ Littman AJ，White E，Jackson LA，et al.Chlamydia pneumoniae infection and risk of lung cancer［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2004，13（10）：1624－1630.

［8］ Anttila T，Koskela P，Leinonen M，et al.Chlamydia pneumoniae infection and the risk of female early－onset lung cancer［J］.Int J Cancer，2003，107（4）：681－682.

［9］ Kocazeybek B.Chronic Chlamydophila pneumoniae infection in lung cancer，a risk factor：a case－control study［J］.J Med Microbiol，2003，52（Pt 8）：721－726.

［10］ Smith JS，Kumlin U，Nyberg F，et al.Lack of association between serum antibodies of Chlamydia pneumoniae infection and the risk of lung cancer［J］.Int J Cancer，2008，123（10）：2469－2471.

［11］ Sessa R，Santino I，Di Pietro M，et al.No evidence of involvement of Chlamydia pneumoniae in lung cancer by means of quantitative real－time polymerase chain reaction［J］.Int J Immunopathol Pharmacol，2008，21（2）：415－420.

［12］ Koh WP，Chow VT，Phoon MC，et al.Lack of association between chronic Chlamydophila pneumoniae infection and lung cancer among nonsmoking Chinese women in Singapore［J］.Int J Cancer，2005，114（3）：502－504.