蛋白组学技术在肿瘤标志物研究中的现状及展望

胡婷婷 胡维博综述 史 健审校

目前肿瘤标志物的检验技术有三大类：生物化学、免疫学、分子生物学方法。免疫法中放射免疫测定(RIA)，酶联免疫测定(ELISA)和免疫荧光测定(IFA)在临床中最常用，近年来双向电泳(2-DE)、PCR、生物芯片、FISH、表面增强激光解吸电离飞行时间质谱( SELDI-TOF-MS)等各项新的技术迅速发展。理想的肿瘤标志物应具有敏感性及特异性高、器官特异性好、半衰期短等特点，而检测方法应精密程度、准确性高，易操作，价格低廉[1]。本文将对蛋白组学技术在肿瘤中的应用进行综述。

1 蛋白组学在肿瘤标志物研究中的意义

应用双向电泳联用质谱技术，蛋白组学规模化地寻找多个与肿瘤相关的蛋白质或蛋白质群，并对其进行定性、定量分析，从整体网络水平了解细胞内信号转导途径，提示肿瘤发病机制，发现肿瘤早期筛选检测和治疗的标志物，必将更科学地指导分子诊断、基因治疗，为攻克恶性肿瘤提供更有利的技术支撑。

2 目前蛋白组学在恶性肿瘤研究中的应用情况

恶性肿瘤的发生、发展过程中，蛋白谱必然会发生一系列变化。肿瘤蛋白质组学主要是通过寻找肿瘤组织或细胞系、血浆与正常样品之间的差异蛋白，初步筛选出与肿瘤相关蛋白质，并后续应用免疫组化、Western、基因转染后确定其表达的差异，通过PCR等技术进行验证，并在早期诊断、细胞凋亡及耐药性、 转移机制、监测疗效和预后方面进行广泛而深入地研究，我们将着重介绍其在肿瘤细胞株中的研究情况。

2.1 在恶性肿瘤早期诊断中的应用

病理诊断是恶性肿瘤诊断的重要依据，但恶性肿瘤依靠影像学及病理诊断时多数已到晚期，目前临床上多通过肿瘤标志物的检测来对早期恶性肿瘤进行普查、鉴别良恶性疾病。在早期发现恶性肿瘤方面，肿瘤标志物的检测拥有独特的优势。很多有效的诊断标志物存在于蛋白质谱(包括差异表达谱、修饰谱)中，并能有效地指导治疗，因此蛋白组学对于发现恶性肿瘤各个病种特异性标志蛋白，为疾病的早期诊断、个体化治疗提供更好的技术平台[2,3]。

在乳腺癌的研究中，Belluco等[4]已建立起早期患者诊断的蛋白图谱。Li等[5]通过对比乳腺癌及乳腺良性疾病患者的蛋白质表达，发现BC1、BC2、BC3在区分良恶性乳腺疾病方面具有特异性，并在后续的试验中证实，BC2、BC3分别为补体C3a及其片段。Alexander等[6]发现巨囊性病液状蛋白(GCDFP-15)、载脂蛋白D(apoD)和α1-酸性糖蛋白(AAG)在乳腺癌患者中呈正调节，且与良性乳腺疾病相比，乳腺癌患者的GCDFP-15水平显著下降，AAG 水平升高，而apoD 则没有显著差异。

王平等鉴定出了包括ATP合成酶、组织蛋白酶、热休克蛋白60、氯离子通道蛋白、乙二醛酶、异质核核糖蛋白A、异质核核糖蛋白AZ/BI和KH型剪切调控蛋白等22种与胃癌相关的蛋白质。

宋大平等[7]通过亚细胞结构蛋白提取法，对比HPV阳性的宫颈永生化细胞及宫颈癌细胞，发现8个可能参与癌前病变向癌转化的差异蛋白，其中3个在宫颈癌细胞株中上调，1 个明显下调，2个缺失,另外 2个在永生化细胞株缺失，遗憾的是未行差异蛋白的验证。

贾小芳等[8]在应用蛋白组学技术，研究人鼻咽癌细胞系(HNE1和CNE1)与永生化的鼻咽上皮细胞系时鉴定出33个蛋白质，其中15个在肿瘤细胞中上调，18个下调，并通过免疫印迹证实与细胞的增殖、凋亡、肿瘤的转移等相关。

2.2 在恶性肿瘤的转移机制中的应用

众所周知，肿瘤的侵袭、远处转移是恶性肿瘤的生物学特性，是肿瘤患者死亡的主要原因。研究恶性肿瘤的转移机制，并适当干预，甚至达到逆转转移，对改善预后具有重要意义。

临床前期研究证明，Hsp27是涉及细胞骨架的稳定,耐药性的产生,细胞凋亡等的1种重要蛋白，其在乳腺癌患者中过表达能增加乳腺癌细胞的侵袭及转移能力。陈栋等[9]以Hsp27高表达的乳腺癌细胞株MCF-7为亲本，通过质粒转染技术，分别导入靶向shRNA敲减载体和对照空载体，分别构建成稳定的细胞系即对照细胞株( Hsp27-KD-NC 细胞株) 和Hsp27敲减细胞株( Hsp27-KD 细胞株)，进行免疫印记鉴定Hsp27的表达量，然后应用双向凝胶电泳及MALDI-TOF-TOF质谱分析技术鉴定出7个差异蛋白点，其中共有4个蛋白点被定性，包含了3种蛋白质，其中2个被鉴定的是Hsp27,另外2个点分别为OVCA2(其在Hsp27-KD-3B2细胞株表达增高)和PYRG2(其在Hsp27-KD-3B2细胞株表达降低),这2种蛋白首次被证实其表达受 Hsp27的影响。

朱文等[10]比较了人高转移大细胞肺癌细胞株L9981和人低转移大细胞肺癌细胞NL9980，有15个蛋白质点仅在L9981中出现,有27个蛋白质点仅在NL9980中出现。

国内外研究证实，nm23-H1基因作为1种肿瘤转移抑制基因，其缺失常伴有侵袭相关分子如E-cadherin，integrin，selectin，VEGF等异常表达，导致肺癌的高转移性和预后差。邓幼林等[11]发现，转染抑癌基因nm23-H1后，原代人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中6个蛋白缺失，17个新的蛋白表达，5个上调，8个下调。这种变化与之前周清华等[12]发现的转基因人高转移大细胞肺癌细胞株(L9981 nm23-H1)中β-catenin、E-cadherin、TIMP-1、CD44S 基因mRNA和蛋白转录表达显著上调，而MMP-2、MMP-9、CD44V6、VEGF、E-seletion基因mRNA和蛋白转录表达显著下调可能有相关性。

冯燕国等[13]验证了在小细胞肺癌中存在膜联蛋白A1 ( Annexins A1)，可能引起细胞集落形成能力增强以及细胞间黏附能力减弱,从而促进肿瘤细胞转移的发生。而刘迎福等[14]则进一步在肺腺癌中验证annexin A1，annexin A2，annexin A3，B23和S100A9等蛋白与转移相关。

李群等[15]通过比较人高低转移性前列腺癌细胞株，鉴定出11种蛋白质，其中9种仅在低转移性细胞株中表达，另外2种仅在高转移性细胞株中表达，涉及到的蛋白种类可分为结合蛋白、凋亡相关蛋白、细胞骨架蛋白及具有磷脂酶C活性的蛋白、具有运载体活性的蛋白，尤其推测其中名为78000 glucose-regulated protein precursor的蛋白与前列腺癌的转移密切相关。

孙成荣等研究高低淋巴道转移性肝癌细胞株，鉴定出168种可能与淋巴道转移相关的差异蛋白，涉及代谢及信号传导通路等因素。

在鼻咽癌转移标志物研究中，通过研究高低转移性鼻咽癌细胞系的差异蛋白，陈丽霞等[16]发现了6种可能与转移相关的蛋白：丙酮酸激酶、β肌动蛋白、20s蛋白酶体、腺嘌呤磷酸核糖转移酶、蛋白酶β-6亚基和血小板活化因子乙酰水解酶，并应用免疫组化技术验证，丙酮酸激酶在高分化鼻咽癌细胞株中明显高于在低分化细胞株中。

2.3 在肿瘤细胞耐药性机制研究方面

研究资料表明，肿瘤细胞多药耐药性的产生，导致化疗失败，是造成肿瘤患者侵袭及远处转移，死亡率升高的重要因素。既往对肿瘤细胞多药耐药性产生机制的研究大多是从某个或某几个基因出发的，且大多集中于DNA、RNA的水平；然而有研究者指出，基因的mRNA表达水平与翻译后蛋白质表达水平之间的相关性为0.4～0.5，而蛋白质组学的技术解决了经蛋白质翻译后加工和修饰以及它们的亚细胞分布情况等问题，从而使得在蛋白质整体水平上来揭示肿瘤多药耐药的详细分子机制成为可能。

紫杉醇(Taxol，TAX)作为治疗妇科恶性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌的重要化疗药物，张正华等[17]以MCF-7及其紫杉醇耐药株MCF-7/Taxol细胞株为靶细胞，应用亲和免疫磁珠层析法获得紫杉醇的结合蛋白，通过SDS-PAGE电泳、LC-MS/MS分析、Western blot验证差异条带中有HSP90、Dermcidin Precursor、Actinin，可能为抗肿瘤药物的研究寻找新的蛋白靶点、发现新的肿瘤耐药机制。张永亮等筛选出初步定性的蛋白：1，6-二磷酸酶、膜联蛋白A2、β-促性腺激素和Ras相关核蛋白，分别涉及肿瘤转移、能量代谢、细胞增殖等相关环节。

Smith等[18]通过对比 MCF-7乳腺癌细胞组和顺铂耐药组，应用MALDI-TOF-MS技术进行分析，发现在顺铂耐药组，细胞角蛋白17、热休克蛋白、核糖体蛋白等9种蛋白低表达，基质金属蛋白酶9、β1蛋白酶体等6 种蛋白高表达，这些生物学标记物有待进一步临床验证。

在肺癌细胞多药耐药性的研究中，有学者验证出肺腺癌对顺铂耐药性的产生与Heat shock protein beta27，ArmexinA2，Cofilin-1，Histone-H4，Triosephosphate isomerase，Peroxinredoxin-4，Vimentin，Proteasome subunit alphatype6，fatty acid-binding proteins，Elongation factor-1等蛋白密切相关。孙强玲等[19]通过荧光差异凝胶电泳，研究紫杉醇耐药及敏感细胞株，鉴定出了涉及代谢酶类、细胞外基质降解酶类、黏附分子、细胞因子和信号转导等19种蛋白。

有学者在卵巢癌细胞株顺铂耐药性的研究方面，提出了14-3-3σ,14-3-3ζ和hNASP，并应用Western blot获得了前者免疫印记图谱，后续仍需进一步验证。周莉等[20]研究掌叶半夏总蛋白对卵巢癌细胞的影响，构建了清晰、重复性好的蛋白图谱，并分析出550个差异蛋白点，为研究中药抗癌提供了新的思路。

甲氨蝶呤为治疗绒癌的首选化疗药物，马海鸥等[21]建立了人绒癌耐药细胞株JAR /MTX蛋白质组双向凝胶电泳图谱，并分析鉴定出1种细胞骨架相关蛋白：埃兹蛋白(ezrin)，并推测此种蛋白过量表达可能抑制肿瘤细胞凋亡，促进浸润、转移。

田浪等[22]对阿霉素耐药的肝癌细胞株HepG2研究，发现了45个差异蛋白点，其中在HepG2/ADM中有7个特异性表达，25个上调，9个下调，在HepG2细胞株中有4个蛋白点特异性表达。

2.4 在恶性肿瘤的预后方面

在食管癌的前期研究中，Ferdous等[23]发现了β-原肌球蛋白(TMβ)、热休克蛋白70(HSP70)、钙磷脂结合蛋白Ⅰ(annexin Ⅰ)、钙网织蛋白(calreticulin)和肌球蛋白一些亚型的表达失调可以作为多种消化系统肿瘤的分子标志物。其后Norihisa等[24]发现谷氨酰胺转移酶-3(TGM-3)与患者生存率正相关，并应用免疫组化进行了验证。

2.5 在细胞周期及其它方面

从细胞周期的角度研究增殖活性与肿瘤的发生及发展是近年研究的热点。正常细胞癌变是细胞过度增殖、凋亡减少与分化受阻的结果。前期研究已构建了清晰、重复性好的肝癌细胞株HepG2在G1期的蛋白图谱。前期研究发现2个卵巢癌中的候选的肿瘤抑制因子OVCA1和OVCA2，可能作为1种具有重要生理作用的旁分泌型的激素，参与细胞凋亡过程。而PYRG2编码CTP合成酶2，是CTP合成中的限速酶，在许多生长旺盛的癌细胞中，这些酶的活性是升高的，因此近年来CTP合成酶是许多癌症治疗的1个靶点，遗憾的是尚未有HSP27影响CTP-2合成机制的研究。

此外，前列腺癌治疗的失败主要是因为由激素依赖期发展为非依赖期，进而发展为激素难治期，导致内分泌治疗无效。王轩久等[25]对这一转化的机制进行了蛋白组学的研究，鉴定出41个3倍差异点及对应着3种蛋白质的10个完全差异点，完全差异点中有1个已知蛋白质是KIAA1283蛋白质,具有载脂蛋白功能；另外首次发现了2个未命名蛋白，有待于进一步研究验证。

3 蛋白组学技术与其它检测方法的共性与区别

肿瘤标志物在检测水平上分为血清、细胞、分子与遗传标志物。现有的检测方法都存在灵敏度差的问题，多数都是在发生某些症状和体征后才发现，难以早期发现某些肿瘤标志物异常，或是难以进行高通量的检测、或因检测方法价格昂贵难以广泛用于临床，导致患者明确诊断时多属晚期，预后差。

蛋白组学区别于其它检测方法，在于其摒弃其它检测方法每次仅可检验单一肿瘤标志物的局限性；且其它方法针对部分与肿瘤相关的抗原进行检测，往往敏感度和特异性差，且具有假阳性、假阴性。多变量分析的蛋白质组学应用被认为在临床应用中更有意义。

蛋白组学相对比其它免疫学检测方法而言，是1种新的高通量的技术手段，具有上样量少，可检出微量蛋白，敏感度、特异性更高的特点，能动态、整体、定量的观察肿瘤发生的过程，通过与正常细胞、组织等相对比，得出疾病相关特异性蛋白质，这对恶性肿瘤的诊断、治疗的指导更有针对性、靶向性、个体化。

总之，目前蛋白质组学在筛选肿瘤标志物方面占有重要地位，特别是初步筛选肿瘤细胞转移相关蛋白及耐药相关蛋白，为逆转肿瘤细胞浸润转移，准确选择有效药物提供新的思路；而亚细胞器的分离及蛋白纯化技术的大力支撑，使取材更加具有针对性；再加上基因转染技术、免疫印记、免疫组化、聚合酶链反应等其它科研方法，必将是人类解释肿瘤规律，从而攻克肿瘤的新希望。但蛋白组学技术具有价格昂贵、样品的分离和提纯技术要求高、对操作人员技术水平的要求、受限于图像分析方法等特点，在广泛临床应用中还存在很多问题，仍有待于进一步解决。

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