类蛋白反应在蛋白水解物风味改善中的研究进展

王 朋，何键东，罗红宇

（浙江海洋学院 食品与药学学院、医学院，浙江 舟山 316000）

类蛋白反应在蛋白水解物风味改善中的研究进展

王 朋，何键东，罗红宇*

（浙江海洋学院 食品与药学学院、医学院，浙江 舟山 316000）

蛋白质在酶解过程中，大量疏水性氨基酸残基暴露出来，产生浓重的苦味影响到蛋白质的风味.在酶的作用下，疏水性氨基酸残基经过类蛋白反应后数量降低，达到风味改善的效果.类蛋白反应与物化法改善蛋白水解液相比，具有无添加、无毒副作用等优点，应用前景广阔.

疏水性氨基酸残基；类蛋白反应；风味改善

0 引言

蛋白质是人体生长发育、保持生命正常活动必不可少的物质之一，大量研究表明，以数个氨基酸结合生成的低肽比氨基酸有更好的消化吸收性能，且营养和生理效果更为优越.因此在营养不良或消化吸收有问题的特定人群的食品配方中，寡肽（由2～10个氨基酸组成）或蛋白质水解物已经逐渐取代氨基酸作为氮源的应用.不仅如此，其中许多肽还具有原蛋白质或其组成氨基酸所没有的新功能，这些生物活性肽都以非活性状态存在于蛋白质长链中，当用适当的蛋白酶水解时，它们的活性就被释放出来.用蛋白酶水解法制得的活性肽具有较高营养价值和良好理化性质，但多有苦味，在食品中的应用受到限制.因此除去或者降低肽类产品苦味，以改善其食用价值，成为食品、医药和生物行业的一大重要研究课题[1].

1 蛋白酶解液苦味产生的原因及影响因素

1.1 苦味产生的原因

研究表明，苦味产生的主要原因在于酶解液中的疏水性氨基酸.在完整的蛋白质分子结构中，疏水性氨基酸通常隐藏在蛋白质分子结构的内部，不与味蕾直接接触，因而感觉不到苦味存在.但是随着水解的进行，蛋白质的空间结构遭到破坏，肽链断裂，疏水性氨基酸残基逐渐暴露，而使酶解液呈现苦味，蛋白质的水解度越高、肽链断裂越多，疏水性氨基酸残基数量也就越多，苦味也就越浓.

1.2 影响因素

蛋白酶解液苦味强度主要受疏水性氨基酸含量、多肽相对分子质量以及酶种的影响.首先，疏水氨基酸的含量、序列及所处的位置、空间结构对苦味的产生有直接的影响，肽的苦味随着疏水氨基酸含量的增加而加重.已有研究表明：合成的多肽中含有苯丙氨酸或酪氨酸残基时，苦味明显，且当苯丙氨酸残基处于C末端，以及肽中苯丙氨酸或者酪氨酸含量增加时，都会使得苦味变得更加强烈[2]；在同分异构体中，C末端为L-苯丙氨酸时会比D-苯丙氨酸苦味强，如用D-苯丙氨酸取代六肽中的L-苯丙氨酸，会使得六肽呈现苦味加强[2].其次，氨基酸数目（或肽链的长度）也影响肽的苦味，苦味肽的链长两三个氨基酸到几十个氨基酸不等.可以通过Q法则（Q=ΣΔf/n，Δf为一个氨基酸残基的疏水性，n为氨基酸残基数量）判定不同相对分子质量的肽是否具有苦味，该法指出肽的苦味与肽的平均疏水性相关，对于相对分子质量小于6 000的肽，Q值小于1 300，没有苦味，而当Q值大于1 400时，会有苦味出现，对于超过6 000的肽，即使Q值大于1 400，也不会出现苦味，但是Q值无法判断苦味强弱[3].再次，酶种和苦味的产生也有一定的联系，研究表明，在苦味强度上，内切酶效果要强于外切酶效果[4].由于内切酶和外切酶在肽链上作用点不同，内切酶从肽链内部进行特异性切割，相比外切酶，更易使疏水性氨基酸残基暴露.此外水解物中总固形物含量对苦味强度也有影响，David Spellman等[5]报道，在相同水解度条件下，总固形物含量为300 g TS/l，其平均苦味值为25.4%，而总固形物含量为50 g TS/l时，平均苦味值为39.9%.

2 类蛋白反应的研究概况

类蛋白反应，又称为合成类蛋白反应或塑蛋白反应，是指在一定条件下，通过蛋白酶的催化将高浓度蛋白质水解物与蛋白酶一起保温，生成一种胶状蛋白类物质的反应[6].类蛋白反应主要分成3个阶段：蛋白酶解液的制备、酶解液的浓缩以及类蛋白合成.早在1901年就有关于酶催化合成蛋白质的报道，在20世纪30年代，研究人员发现生物合成蛋白质的过程中伴随着酶促反应的逆过程，到了20世纪70年代，酶催化合成蛋白质成为热门研究领域[7].类蛋白反应改善了蛋白质的风味，提高了生物蛋白的性价比.

2.1 类蛋白反应的脱苦机理

尽管类蛋白反应已经有上百年的历史，但是对于其反应机制仍然存在很大的争议，早期的观点认为类蛋白反应是简单动力学驱使的蛋白水解的逆反应.后期经过证明类蛋白反应的产物是一种新的蛋白质，而不单纯是蛋白水解的逆反应.目前关于类蛋白反应的机理主要有以下几种.

2.1.1 转肽作用和缩合作用

转肽作用（Transpeptidation Reaction）是指肽的氨基酸残基或者酰胺基和其他肽的氨基酸残基或者酰胺基进行交换转移.在酶法制备类蛋白试验中，利用过氧化苯甲酰-l-亮氨酸作为底物，加入木瓜蛋白酶和甘氨酸酰苯胺，甘氨酸残基游离出来，并且生成了过氧化苯甲酰-l-亮氨酸酰苯胺，证实了转肽作用的存在[8].在试验中使用两种不同的二肽作为底物，在蛋白酶的作用下，形成了一种新的二肽[9]，在胃蛋白酶催化下的蛋白合成反应中，通过转肽作用，生成了一些聚合产物，其中包括了一些新合成的寡肽[10].在类蛋白反应过程中，大小不同的相对分子质量的肽都有一定程度的增加[11].

缩合反应（Condensation reaction）是蛋白水解反应的逆反应，酶与浓缩液中短肽的羧基反应脱去水，后与其他短肽反应生成新的蛋白[12].Yamashita等[13]报道将大豆球蛋白作为底物和α-胰凝乳蛋白酶混合物浓缩至50%，利用18O标记羧基，这些18O最后出现在水中，证实了此过程中缩合反应起了主导作用.研究表明，在浓度较高时，类蛋白反应主要依赖于缩合反应，而在较低浓度时，转肽作用明显强于缩合作用.

2.1.2 疏水作用

在类蛋白反应中，疏水作用是关键因素之一，酶解产物在疏水作用下以非共价键形式结合在一起，生成不溶性蛋白质胶体即类蛋白，这种水介质中的球状蛋白质分子的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子内部，从而降低酶解物的苦味，疏水性越强越有利于类蛋白反应的进行.Edwards等[14]利用α-胰乳蛋白酶和木瓜蛋白酶处理的鸡蛋清作为底物合成类蛋白，并用SDS凝胶电泳对类蛋白产物进行分析，没有发现高分子，发现产物量产物，证实非共价键在合成类蛋白过程中起作用.Julio等[15]在测定肽链长度时，在pH4.7，温度 37℃条件下，利用木瓜蛋白酶催化14C标记的蛋氨酸乙酯与胃蛋白酶消化的大豆蛋白酶解液合成类蛋白，通过对14C原子的追踪，发现不论底物和产物，肽链中均含有6个氨基酸残基，试验期间并无高相对分子质量蛋白质产生，表明在该过程中共价键起到的作用很小.

2.2 合成类蛋白反应的控制条件

2.2.1 底物浓度和酶种对合成类蛋白反应的影响

合成类蛋白反应中，底物浓度以及酶种对合成类蛋白反应效率和产量有着重要的影响.底物浓度越高，可以有效降低肽链合成中对自由能的需求，从而有利于合成反应，提高类蛋白的产量[16]；当底物浓度小于5%，此时水解反应占主导地位，而水解反应与类蛋白反应的临界点介于6%～8%之间，底物浓度在11%～43%时，类蛋白合成量有一个线性增加的过程[17].当底物浓度介于30%～40%时，类蛋白产量能达到最大值[18].

在类蛋白合成反应中，酶种的选择也起着重要的作用，Williams等[17]研究了不同酶种对类蛋白反应的影响，以类蛋白产量作为指标，发现在pH5.0，底物浓度1%时，胃蛋白酶合成的类蛋白产率为13.0%，效果要明显优于木瓜蛋白酶（10.0%）、胰蛋白酶（12.6%）和胰凝乳蛋白酶（10.4%）.同时研究发现，水解和类蛋白反应采用同种酶时，其合成活性越高，类蛋白产量也越高.崔铁军[18]报道，利用鱼蛋白合成类蛋白，在相同底物浓度（40%）、相同温度（37℃）、pH=5的条件下，胃蛋白酶合成类蛋白的含量高达33.12%，优于胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶（pH=7）.常用的酶种主要以胃蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶等内切蛋白酶为主[19].

2.2.2 起始pH对合成类蛋白反应的影响

大部分蛋白质、寡肽和多肽的等电点集中在4.0～7.0之间，因此，当反应体系的pH介于4.0～7.0之间，体系生成的凝胶，便于类蛋白的合成[20-23].不同的酶在类蛋白合成过程中，对初始pH要求不同，Yamashita等[24]在其研究中定义ΔpH，即最适合成pH与最适酶解pH的差值，根据ΔpH值的大小将合成类蛋白反应划分为3种类型.当ΔpH＞0时，胃蛋白酶型；ΔpH=0时，木瓜蛋白酶型；ΔpH＜0，胰凝乳蛋白酶型，胰蛋白酶除外.

2.2.3 温度对合成类蛋白反应的影响

类蛋白反应和蛋白酶解一样，均为酶促反应，在这个过程中，温度对酶的活性有较大影响，进而影响到反应.在一定的反应时间内，类蛋白含量会呈一个上升趋势，当温度继续升高时，类蛋白含量不再继续增加.朱晓杰等[25]利用海地瓜酶解物进行类蛋白修饰时发现，45℃条件下，游离氨基酸含量减少最快，此时类蛋白产量达到最大；Williams等[17]分别在20℃、37℃、50℃和65℃条件下进行类蛋白反应，发现在 37～50℃之间类蛋白产量较高，65℃条件下，3 h内类蛋白含量能达到93%，6 h后类蛋白含量不再增加，但是由于温度过高时，蛋白容易变性，因此合成类蛋白的最佳温度为37～50℃.

2.2.4 底物相对分子质量对合成类蛋白反应的影响

底物的相对分子质量也对合成类蛋白有着很重要的影响，大多认为低相对分子质量短肽是合成类蛋白反应的最佳底物[2,26-27]，一般合成类蛋白最有效的底物平均相对分子质量介于685～1 043之间，肽链中含有5～6个氨基酸残基，当相对分子质量低于或者高于该范围时，合成效果不理想[22,26].利用玉米醇溶液合成类蛋白过程中，发现含有4～6个氨基酸残基的短肽作为底物更适合制备类蛋白；用不同链长的肽合成类蛋白时，最适宜肽链应包含5～6个氨基酸残基；将大豆蛋白水解物按相对分子质量划分为4段，分别在pH6.5，底物浓度35%条件下合成类蛋白，发现第2段（平均相对分子质量为1 043）和第 3段（平均相对分子质量为 685）要比小于685和大于1 043的合成效果更好[28].

2.2.5 其他因素对合成类蛋白反应的影响

张雅丽等[29]在利用大豆蛋白和芝麻蛋白合成类蛋白质的研究时发现，水解度在40%、50%时，无类蛋白生成，并且出现了微量的水解反应，随着水解度的提高，类蛋白合含量也随之提高，当水解度达到80%，类蛋白含量达到最大量，水解度继续提高时，类蛋白含量开始下降.另外，不同原料来源的水解蛋白，即使以适宜合成类蛋白反应的形式参与反应，其产物产量也存在很大的差别，如以胃蛋白酶为催化剂，以大豆蛋白的胰蛋白酶水解物和芝麻蛋白的胰凝乳蛋白酶水解物为底物，合成类蛋白反应的产物产率高；而采用菌类蛋白在最适条件下合成类蛋白反应的产率较低[11].

2.3 类蛋白在蛋白水解物风味改善中的应用

蛋白水解物常用的脱苦方法有物理、化学以及酶法等.物化方法在脱苦过程中常常会带来一定的有害物质，不宜应用于食品、医药行业，而类蛋白反应无化学物质添加，无毒副作用，是一种良好的脱苦方法，具有重要的现实意义.研究人员已经利用植物蛋白[30-31]、动物蛋白以及微生物蛋白水解产物作为底物合成类蛋白[17,32-33]，同时他们发现，类蛋白反应能有效改善蛋白酶解液的腥苦味问题，提高了蛋白质的营养价值并改善了蛋白质的功能特性.由于类蛋白反应过程中产生的凝胶，使得疏水性氨基酸残基得以富集，减少与味蕾的接触，降低了苦味的强度.在类蛋白反应浓缩阶段，可以通过添加一些必需氨基酸，来改善多肽的营养价值.Fujimaki等[34]以浓度为20%大豆蛋白水解物作为底物，在pH7，37℃条件下反应24 h，苦味基本消失.Arai等[35]报道用大豆水解产物合成类蛋白，在酸性磷酸酶A（Aspergillopeptidase A）和酸性羧肽酶（aspergillus Acid Carboxypeptidase）催化下，能够水解产物中的异嗅物质和苦味[34].Synowiecki等[36]以牛红细胞Alcalase水解产物（强烈苦味）作为底物，催化类蛋白合成反应中苦味降低至原来50%.Kanekanian等[37]用中性蛋白酶处理脱脂乳中提取的酪蛋白，经凝胶层析后，得到3种苦味组分，利用反相液相高效色谱法进行分析，具有强烈苦味的第一组分，经过碱性蛋白酶和中性蛋白酶处理后，苦味明显降低，脱苦的水解物的峰发生了明显变化，疏水性区域向亲水性区域转变.用蛋白酶SK11（Lactococcus lactis subsp.cremoris） 处理契达干酪中提取的苦味肽，苦味明显减轻，他们提取出五种苦味成分，这些成分中富含脯氨酸[38].周春霞等[39]利用类蛋白反应对罗非鱼加工下脚料进行风味改善，产物基本没有苦味.以不同疏水性的二肽作为模型，研究蛋白酶催化类蛋白反应改善蛋白酶解物苦味方法的可行性，在推动浓缩反应中，不溶性物质起着关键作用，这个方法是改善水解产物苦味肽风味的一个潜在途径[9].

3 展望

我国是一个水产大国，渔业产量居世界前列，但是对于水产品加工利用率低，原料浪费严重，出口产品仍以初级加工产品为主，蛋白类制品等高端产品较少.类蛋白合成可以有效改善蛋白制品的风味，提高消费者对产品的接受程度，推动该类产品的生产和销售，从而有效提升水产品加工的附加值.早在20世纪初，就已经有研究人员利用蛋白酶催化合成蛋白质的报道，到20世纪七八十年代，日本研究人员以大豆蛋白酶解液作为底物进行类蛋白的合成试验，深入研究了类蛋白合成所需要的条件，这是国外研究合成类蛋白的巅峰时期，不过，我国在类蛋白合成方面的研究起步较晚，报道也较少，先有利用鱼蛋白合成类蛋白、后来有利用大豆蛋白和芝麻蛋白合成类蛋白，又有以大米蛋白、玉米蛋白为底物合成类蛋白的报道.在当今社会，绿色、天然食品深受广大消费者的喜爱，而且多肽产品较之蛋白质更容易被人吸收，非常适合广大的老年人和婴幼儿.但由于合成类蛋白反应产物产量低而且具有可逆性，在进一步加工过程中，苦味可能重新形成，相对于其他风味改善方法，其成本较高，因此今后将在对类蛋白反应机理的进一步、系统研究的基础上，在反应工艺的可控性、产品的稳定性、成本降低等领域进行重点研究，促成该技术的熟化并扩大应用范围.

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RESEARCH PROGRESSON PLASTEIN REACTION IN FLAVOR IMPROVEMENT OF PROTEIN HYDROLYSATE

WANG Peng，HE Jian-dong，LUO Hong-yu
（School of Food，Pharmacy and Medicine，Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316000，China）

In the enzymatic hydrolysis process of protein，protein could produce heavy bitter taste due to a large amount of hydrophobic am ino acid residues were exposed.Under the action of enzyme，the amount of hydrophobic am ino acid residues was reduced after plastein reaction so as to improve the flavor.In comparison w ith physicochemicalmethod，the plastein reaction has the advantages of no additives，no toxic and side effects and w ide application prospect.

hydrophobic am ino acid residues； plastein reaction； flavor improvement

TS201.2

A

1673-2383（2012）02-0089-06

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20120427.1359.020.html

网络出版时间：2012-04-27 01:59:37 PM

2011-11-12

王朋（1987-），男，山东潍坊人，硕士研究生，研究方向为海洋生物资源与利用.

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