FLAG标记的Kir2.3通道的构建、表达及其对Kir2.3通道功能的影响

赵志英，朱宏谦，张 哲，刘 丽，张国红

（1.河北医科大学基础医学院药理学教研室，教育部血管与神经生物学重点实验室，河北省新药药理毒理研究重点实验室，河北石家庄050017；2.河北省公安厅国家安全保卫总队，河北石家庄050000 3.河北省人民医院临床医学研究中心，河北省老年医学重点实验室，河北石家庄050051）

·论 著·

FLAG标记的Kir2.3通道的构建、表达及其对Kir2.3通道功能的影响

赵志英1，朱宏谦2，张 哲3，刘 丽1，张国红1

（1.河北医科大学基础医学院药理学教研室，教育部血管与神经生物学重点实验室，河北省新药药理毒理研究重点实验室，河北石家庄050017；2.河北省公安厅国家安全保卫总队，河北石家庄050000 3.河北省人民医院临床医学研究中心，河北省老年医学重点实验室，河北石家庄050051）

目的构建FLAG标记的内向整流钾通道（inwardly rectifying K channel，Kir）2.3通道蛋白，为进一步研究通道的生理功能和调节机制奠定基础。方法运用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术，将FLAG标记短肽DNA碱基序列插入到Kir2.3通道氨基末端，构建重组质粒DNA，FLAG-Kir2.3-pGEMHE；采用菌落PCR方法挑取阳性克隆，表达于非洲爪蟾卵母细胞，验证加入标记后是否影响Kir2.3通道蛋白的功能；进行免疫细胞化学实验，检测FLAG标记短肽表达情况。结果经测序验证，FLAG-Kir2.3-pGEMHE重组质粒DNA构建成功，没有碱基突变。FLAG标记短肽没有影响Kir2.3通道功能，FLAG-Kir2.3成功表达于非洲爪蟾卵母细胞，双电极电压钳可以记录到电流。免疫细胞化学实验证实FLAG标记短肽表达。结论成功构建重组质粒DNA，FLAG标记短肽已与Kir2.3通道蛋白成功融合并有效表达。

钾通道，内向整流；聚合酶链反应；免疫组织化学

内向整流钾通道（inwardly rectifying K channel，Kir）是在各种组织中广泛分布的一种钾离子通道，Kir2.0钾通道的特征是具有很强的内向整流特性，这种通道的整流作用有利于维持细胞的静息电位并参与复极化过程［1］。Kir2.3是Kir2.0家族中的重要一员，已知可以被细胞内或细胞外的信号分子如Mg2+、多胺、H+、PKC等调控［2］。研究Kir2.3的调控机制对研究内向整流钾通道家族的调控机制有重要意义。FLAG是通用抗原表位标记物之一，已广泛应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及蛋白相互作用等领域。本实验将FLAG标签连接于Kir2.3氨基末端［3］，构建重组质粒DNA，FLAG-Kir2.3-pGEMHE，为进一步研究Kir2.3通道蛋白的生理功能和调节机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料：Kir2.3 cDNA克隆于质粒pGEMHE中，pGEMHE载体质粒DNA由美国纽约大学西奈山医学院（Mount Sinai Medical School）生理学系Diomedes Logothetis教授惠赠。Anti-FLAG M5 monoclonalantibody购自美国Sigma公司，PyrobestTM DNA Polymerase购自日本Takara公司。实验用非洲爪蟾（Xenopus laevis），购于中科院上海神经科学研究所。

1.2 方法

1.2.1 构建重组质粒DNA：FLAG-Kir2.3-pGEMHE设计引物，将FLAG标记短肽（DYKDDDDK）插入到Kir2.3-pGEMHE的DNA碱基序列氨基末端，同时加入酶切位点EcoRI及保护性碱基，设计引物如下，上游引物（50 bp）5' AGGAATTCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGCACGGACACAGC 3'，下游引物（24 bp）5' ACCAGATCAAGCTTGCTCTAGAGA 3'。采用高保真DNA聚合酶进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）反应，PCR回收产物及载体pGEMHE质粒DNA同时进行EcoRI酶切，载体去磷酸化，连接产物转化后，采用菌落PCR筛选阳性克隆，菌落PCR引物如下，上游引物（24bp）5' TCTTCTCCGCGGCCTTCCTTGTCT 3'，下游引物（24 bp）5'CGGGCAGCACGGTGATCTTACTCT 3'。用BamHI鉴别插入片段方向是否正确［4-5］。经测序选取无碱基突变的克隆。

1.2.2 重组FLAG-Kir2.3通道蛋白表达于非洲爪蟾卵母细胞：将重组质粒DNA和Kir2.3-pGEMHE质粒DNA同时用限制性核酸内切酶NheI线性化，用RibomaxTM Large Scale RNA Production Systems-SP6 and T7 Kit试剂盒进行体外转录得到它们的cRNA。分离爪蟾卵母细胞，胶原酶消化为单个细胞后用ND96清洗细胞。将FLAG-Kir2.3和Kir2.3 cRNA分别注入爪蟾卵母细胞，18℃培养。双电极电压钳（two-microelectrode voltage clamp，TEVC）记录电流是否表达。灌流液ND96（mmol/L），NaCl 96，KCl 1，MgCl21，CaCl21.8，HEPES 5，用NaOH调节pH为7.4；ND96K（mmol/L），KCl 96，NaCl 1，MgCl21，CaCl21.8，HEPES 5，用KOH调节pH为7.4。

1.2.3 免疫细胞化学实验：将表达带有FLAG标记短肽的Kir2.3通道蛋白的爪蟾卵母细胞与表达未带有FLAG标记短肽的Kir2.3通道蛋白的爪蟾卵母细胞同时进行4%多聚甲醛固定过夜，PBS清洗3次过夜，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制成切片，相邻切片做HE染色和免疫细胞化学实验［6］。免疫细胞化学实验将切片进行抗原修复，封闭血清封闭，Anti-FLAG M5单克隆抗体4℃过夜，PBS清洗3次，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠IgG，37℃45min，PBS清洗3次，DAB显色，光镜下观察是否有阳性表达及其表达部位。

2 结 果

2.1 构建重组质粒DNA：Kir2.3通道蛋白氨基末端（N末端）在细胞内起始，2次跨膜折叠后羧基末端（C末端）在细胞内终止，N末端较短，C末端较长，且C末端对通道在细胞膜的定位与信号传导有重要作用。所以我们选择在Kir2.3通道N末端添加FLAG序列。以Kir2.3-pGEMHE质粒DNA为模板DNA，经过PCR反应，得到的产物片段长度与Kir2.3的碱基数相似，约为2 000bp（图1）。PCR扩增产物经测序结果证实为目的产物，非假阳性扩增。PCR回收产物及载体pGEMHE质粒DNA分别用EcoRI酶切并纯化。因本次连接反应为同源黏末端连接，为了最大程度减少载体自身连接反应，减少高背景假阳性克隆，载体必须进行去磷酸化。进行菌落PCR筛选阳性克隆。在900 bp处有条带为阳性克隆，无条带为阴性克隆（图2），1、3、4、5、6、11、12、13为阳性克隆。挑取其所对应的菌落，进行扩菌增菌，提取质粒DNA，用限制性核酸内切酶BamHI鉴别插入片段方向是否正确。因为酶切位点BamHI在载体pGEMHE和插入片段Kir2.3的DNA序列中都存在，酶切位点BamHI在pGEMHE的DNA序列第83位，在酶切位点EcoRI上方6个碱基，Kir2.3的DNA碱基数为1 913，酶切位点BamHI在其DNA序列第1 677位，因此，若为正向连接，BamHI酶切可得2个片段3 341bp和1 594bp，若为反向连接，BamHI酶切可得2个片段4 616bp和319bp（图3），可见3、6、12为正向连接。将连接正确的克隆进行测序，筛选无碱基突变的克隆，至此重组质粒DNA构建成功。

2.2 PMA对Kir2.3和FLAG-Kir2.3通道电流的作用：将由重组质粒DNA和Kir2.3-pGEMHE质粒DNA转录而来的cRNA分别注入卵母细胞，记录电流。PMA为PKC激活剂，可以明显抑制Kir2.3电流。首先在高钾细胞外液（ND96K）中，-80mV～+80mV的斜坡电压记录电流，图4A所示为Kir2.3电流及给PMA后电流-电压曲线变化，图4B所示为重组通道电流及给PMA后的相应电流-电压曲线变化，最后用ND96外液冲洗以建立零电流基线（ND96外液中，Kir2.3在-80mV电流很小）。图4C、D为以上2种通道在给PMA前后电流-时间变化结果。虚线为零电流，虚线下曲线为钳制电压为-80mV电流，虚线上曲线为钳制电压为+80mV电流，结果显示0.5μM PMA能够明显抑制2种通道电流，抑制率分别为（46.3±5.2）%、（44.8± 6.1）%，PMA对2种通道的抑制率经比较差异无统计学意义（P＞0.05）。这说明FLAG标记短肽未影响Kir2.3通道蛋白表达及其电流特性，为以后研究Kir2.3通道蛋白的特性和调节机制奠定了基础。

2.3 免疫细胞化学实验：使用Anti-FLAG M5 monoclonal antibody，可以特异性与FLAG肽段结合，再加入辣根过氧化物酶耦联的二抗，经免疫细胞化学染色，可见表达FLAG-Kir2.3重组通道蛋白的爪蟾卵母细胞细胞膜有棕黄色沉淀颗粒聚集，表达Kir2.3通道蛋白的爪蟾卵母细胞细胞膜却未见有特异性沉淀颗粒聚集（图5A，B）。由于Kir2.3通道蛋白是膜蛋白，所以棕黄色沉淀颗粒聚集于细胞膜，证实了FLAG标记短肽确实已与Kir2.3通道蛋白成功融合并稳定表达。

3 讨 论

DNA重组技术是一项复杂庞大的系统工程，简单地说，它包括4个大的步骤，目的基因的获得；目的基因与载体的体外重组；重组后的DNA分子导入受体细胞；转化细胞的筛选和外源基因的表达。抗原表位标记是一项很有用的技术，可以鉴定未经纯化的感兴趣的蛋白，能够使用经过很好的鉴定和高度特异性的抗体来研究感兴趣的蛋白，不用经长时间费力的过程来生产和鉴定抗体。大多数蛋白可以在一端或其他区域接受标记物，不严重丧失功能。但应尽量把表位标记物加在靶蛋白的氨基或羧基末端，这样最可能接近抗体，而最不可能干扰靶蛋白的功能。FLAG是常用的抗原表位标记物，可以通过蛋白酶水解切割从靶蛋白中除去，当把FLAG序列加在靶蛋白的氨基末端，需要在其碱基序列前加起始密码子ATG［7］。FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利于研究人员对融合蛋白进行下游研究，现FLAG标签已广泛应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等领域［8］。虽然现在商品化带有FLAG标签的真核表达载体很多，但本实验在非洲爪蟾卵母细胞进行表达，可以选择的载体只有pGEMHE，不能用现成的表达载体，增加了实验难度。

进行抗原表位标记的方法很多，常用为PCR，如在PCR引物序列中加入抗原表位碱基序列以及重叠延伸PCR等。本实验采用方法为在PCR引物中加入FLAG碱基序列，PCR循环数应尽量少，以减少平台效应和非特异性扩增产物干扰，减少碱基突变发生率。为便于克隆，还要在引物两端加上酶切位点和保护性碱基。载体与插入片段以相同的限制性核酸内切酶进行切割，形成同源黏末端，这是最方便的克隆途径。本实验由于载体质粒pGEMHE中酶切位点很少，可以选择的酶切位点只有EcoRI，故本次试验只能用单酶切进行连接，无疑增加了实验难度。由于本实验上下游引物所加酶切位点相同，用同一种限制酶剪切形成的载体片段，其两个末端的序列是互补的，在连接反应中能够自身连接，恢复成环，重新形成原来的载体分子，因此在连接前，必须将线性载体分子进行5'末端脱磷酸化处理，使载体分子无法自身连接成环，而带有5'端磷酸基团的外源DNA片段在DNA连接酶作用下可有效的与去磷酸化的质粒DNA连接，形成含2个缺口的开环分子，开环分子的转化效率明显高于去磷酸化的线状DNA。因此，脱磷酸化处理后进行连接反应时，加大连接酶的用量方能达到有效连接，减少克隆过程中“空心”克隆产生的数目。由于有高背景假阳性克隆存在，为阳性克隆筛选增加了很多麻烦，采用菌落PCR扩增筛选法，既准确又简单、经济有效［4］。由于此步骤只是筛选故不必用高保真DNA聚合酶。在连接反应中适当增加插入片段与载体的摩尔比也是行之有效的一种方法。送样品测序时要多送几个样品，尤其是本实验，插入片段为2 000bp，突变几率大，对保真性要求高。重组DNA成功表达于非洲爪蟾卵母细胞，双电极电压钳记录电流有表达，PMA对FLAG标记的重组通道的抑制程度与没有带有FLAG标记的Kir2.3通道相同［9］。免疫细胞化学实验证实FLAG抗原表位标记短肽确实已与Kir2.3通道蛋白成功融合并有表达［10］。通过在PCR引物序列中加入FLAG序列所对应的DNA碱基序列，成功构建了FLAG-Kir2.3-pGEMHE重组通道，FLAG标记稳定表达且未影响Kir2.3通道蛋白功能，为进一步研究Kir2.3通道的生理功能和调节机制奠定了基础。（本文图见封二）

［1］ROBERTSONJL，PALMERLG，ROUXB.Multi-ion distributions inthecytoplasmicdomainofinwardrectifier potassium channels［J］.Biophys J，2012，103（3）：434-443.

［2］ZHANG DY，ZHANG YH，SUN HY，et al.Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase regulates the humaninward rectifier potassium K（IR）2.3 channel，stably expressed in HEK 293 cells［J］.Br J Pharmacol，2011，164（5）：1469-1478.

［3］FERRER T，PONCE-BALBUENA D，LOPEZ-IZQUIERDO A，et al.Carvedilol inhibits Kir2.3 channels by interference with PIP2-channel interaction［J］.Eur J Pharmacol，2011，668（1/ 2）：72-77.

［4］梅志强，张连美，于海清，等.改良菌落PCR快速鉴定TRIM28基因阳性重组子的方法研究［J］.泸州医学院学报，2012，35（3）：241-244.

［5］王玉，于爱莲，姜世金，等.改良菌落PCR法筛选、鉴定DHBV部分核衣壳蛋白基因的重组克隆［J］.中国病原生物学杂志，2012，7（3）：264-268.

［6］ORTEGA B，MASON AK，WELLING PA.A tandem Dihydrophobic motif mediates clathrin-dependent endocytosis via direct binding to the AP-2 ασ2 subunits［J］.J Biol Chem，2012，287（32）：26867-26875.

［7］高淼，黄峥兰，李千音，等.嵌合腺病毒Ad5F35-FLAG-3NLS-FRB*的构建与鉴定［J］.中国生物制品学杂志，2012，25（10）：1276-1280.

［8］邹少林，丁先锋，郭江峰.重组FLAG标签的融合表达纯化及亲和常数的测定［J］.科技通报，2010，26（3）：350-357.

［9］WANG G，ZENG J，SHEN CY，et al.Overexpression of Kir2.3 in PC12 cells resists rotenone-induced neurotoxicity associated with PKC signaling pathway［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，374（2）：204-209.

［10］李涛，于文燕，欧小利.带FLAG标签小鼠HuR真核表达载体的构建及其生物学功能的鉴定［J］.解放军医学杂志，2011，36（4）：352-355.

（本文编辑：赵丽洁）

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《河北医科大学学报》编辑部

CONSTRUCTION OF FLAG TAGGED KIR2.3 CHANNEL，ITS EXPRESSION AND FUNCTIONAL STUDY

ZHAO Zhiying1，ZHU Hongqian2，ZHANG Zhe3，LIU Li1，ZHANG Guohong1
（1.Department of Pharmacology，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University；The Key Laboratory of Neural and Vascular Biology，Ministry of Education；The Key Laboratory of New Drug Pharmacology and Toxicology，Hebei Province，Shijiazhuang 050017，China；2.National Security Corps，Public Security Department of Hebei Province，Shijiazhuang 050000，China；3.The Clinical Trial Center People's Hospital of Hebei Province；Hebei Provincial Key Laboratory of Geriatrics，Shijiazhuang 050051，China）

ObjectiveFlag tag will be inserted into the upstream of Kir2.3-pGEMHE DNA sequence，which will lay a basis for future research.MethodsThe DNA base sequence corresponding to the amino acid sequence of Flag peptide was inserted into the N-terminus of Kir2.3 by polymerase chain reaction（PCR）.The recombinant plasmid DNA FLAG-Kir2.3-pGEMHE was constructed.The correct clones were chosen by the method of colony PCR and sent for sequencing.Flag-Kir2.3 was expressed in the Xenopus oocytes.The function of FLAG tagged Kir2.3 channel was studied.Immunocytochemistry method was applied to confirm that the Flag-Kir2.3 was expressed on the membrane of the Xenopus oocytes.ResultsAfter examination by sequencing，the Flag tag was found to be inserted into the N-terminus of Kir2.3-pGEMHE.FLAG-Kir2.3 was expressed in the Xenopus oocytes successfully. Channel currents were recorded by two-microelectrode voltage clamp（TEVC）.Immunocytochemistry experiments showed that the Flag tag was fused with Kir2.3 channel protein successfully.ConclusionFLAG-Kir2.3-pGEMHE was constructed by means of PCR successfully.Moreover，the Flag tag did not affect Kir2.3 channel function.These results laid a basis for future research.

potassiumchannels，inwardlyrectifying；polymerasechainreaction；immunohistochemistry

R966

A

1007-3205（2012）12-1365-04

2012-11-12；

2012-12-03

国家自然科学基金资助项目（30900267）；教育部高等学校博士点新教师基金资助项目（20091323120006）；河北省卫生厅医学重点指导项目（20090321）

赵志英（1975-），女，河北保定人，河北医科大学基础医学院副教授，医学博士，从事离子通道药理学研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.12.001