真核肽链释放因子eRF3b在人肝组织及体外肝细胞中的表达

李 曼，贾 媛，员美娜，刘志鹏，刘殿武

（河北医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室，河北石家庄 050017）

·研究快报·

真核肽链释放因子eRF3b在人肝组织及体外肝细胞中的表达

李 曼，贾 媛，员美娜，刘志鹏，刘殿武*

（河北医科大学公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室，河北石家庄 050017）

肝细胞；真核细胞；细胞培养技术

在真核细胞中，真核释放因子eRF3有许多功能，它控制调节细胞周期由G1期到S期的转相［1］，在翻译终止过程中以GTP依赖的形式调节蛋白的合成［2］等，本室前期利用飞行质谱检测到乙型肝炎病毒相关肝病中存在着差异蛋白真核肽链释放因子3b（eukaryotic peptide chain release-factor GTP-bind subunit，eRF3b），本研究对其在不同组织细胞中的表达进行分析，旨在为其作用机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 组织来源：河北医科大学第四医院外科手术切除的肝癌4例，并取癌旁组织4例作为对照。石蜡包埋后切片，进行HE染色和免疫组织化学染色；细胞来源，QSG-7701（正常人肝细胞），HepG2（人肝癌细胞），HepG2.215（乙型肝炎病毒感染的人肝癌细胞），10%胎牛血清培养，进行免疫组织化学染色。

1.2 Real time RT-PCR：引物由NCBI-Primer 3.0设计，上海生工生物工程公司合成。应用Quant One Step qRT-PCR（SYBR Green 1）Kit于20μL体系内进行扩增，仪器为Rotor-GeneTM6000。循环条件为，50℃反转录30 min，95℃预变性2 min，94℃变性20s，68℃延伸20s，共40个循环。

1.3 Wstern Blot：细胞总蛋白上样量60μg，20mA恒流2h；切胶后进行干转移1.5h；经过封闭，一抗、二抗孵育及洗脱后，远红外成像：奥德赛双色远红外成像系统700 nm通道进行扫膜并保存图像。

1.4 统计学方法：应用SAS 9.3统计软件分析，计量资料以±s表示，多组均数的比较采用ANOVA方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组织化学检测eRF3b蛋白的表达：4对肝组织标本（癌和癌旁组织）HE染色结果显示癌旁组织可见细胞核圆，细胞排列整齐。肿瘤细胞排列凌乱，增生活跃，呈多边形，核大，核浆比例增大，核分裂相易见。免疫组织化学结果显示，在4对组织中，eRF3b的表达在癌旁组织有2个为（ +），2个为（-），在癌组织中，1个表达（ ++），有2个为（+），1个为（-）。eRF3b/GSPT2蛋白在QSG-7701、HepG2以及HepG2.215内也是阳性表达。

2.2 不同细胞系基因水平表达差异：△△Ct相对定量结果显示GSPT2在各细胞株的表达有所差异，在 HepG2细胞中表达量高于正常细胞以及HepG2.215细胞，而ERF1以及GSPT1在HepG2. 215中表达量明显高于其他2种细胞株。

2.3 不同细胞系 eRF3b蛋白水平表达情况：Western Blot检测可见 eRF3b蛋白特异性条带，eRF3b/α-tublin的比值，肝癌细胞珠HepG2的相对表达量0.73，QSG-7701和HepG2.215细胞株分别为0.25及0.24。

3 讨 论

本室前期对乙型肝炎病毒相关疾病患者血清进行质谱检测，发现相对分子质量4 210的差异性蛋白片段，在慢性乙型肝炎血清和肝癌血清中差异显著，后经二级质谱鉴定属于真核肽链释放因子3b，即eRF3b，所以研究设想eRF3b是否和肝癌之间存在着某些联系。基于此，本研究首先对eRF3b在肝组织的表达进行了免疫组织化学分析，因为只是定性分析eRF3b是否在肝组织表达，研究中仅用了4对肝癌及癌旁组织，结果显示eRF3b在肝组织为阳性表达。本研究接下来用Western Blot对eRF3b在不同类型肝细胞的表达情况进行测定，结果可见特异性条带，相对分子质量位于60 000与94 000之间，大约为83 000，与预期的相对分子质量68 883有所差别，但与文献报道一致［3］。本研究还进一步分析了不同肝源细胞系中eRF3b在mRNA水平及蛋白水平的表达，发现eRF3b在HepG2的表达量高于QSG-7701以及HepG2.215，真核肽链释放因子eRF1以及 eRF3a/GSPT1在HepG2.215表达量最高，在不同类型细胞中出现的表达量差异的原因有待进一步研究。

［1］ ZHOURAVLEVA G，FROLOVA L，LE GOFF X，et al.Termination of translation in eukaryotes in governed bytwointeracting polypeptide chain release factors，eRF1 and eRF3［J］.EMBO J，1995，14（16）：4065-4072.

［2］ OZAWA K，MURAKAMI Y，EKI T，et al.Mapping of the human GSPT1 gene，a human homolog of the yeast GST1 gene，to chromosomal band 16p13.1［J］.Somat Cell Mol Genet，1992，18（2）：189-194.

［3］ JAKOBSEN CG，SEGAARDTM，JEAN-JEMND，etal. Identification of eRF3b，a human polypeptide chain release factor with eRF3 activity in vitro and in vivo［J］.Molecular Biology，2001，35（4）：575-583.

（本文编辑：刘斯静）

R575.1

B

1007-3205（2012）09-1091-02

2012-06-27；

2012-08-01

国家自然科学基金（30972516）；河北省自然科学基金（C2010000481）；河北省卫生厅重大科技攻关项目（20090004）

李曼（1977-），女，河北保定人，河北医科大学公共卫生学院讲师，医学博士，从事肝病分子流行病研究。

*通讯作者。E-mail：liudw56@tom.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.09.041