蛋白质组学在肺癌与肺结核病鉴别诊断中的研究进展

张双林，孙明飞，宋言峥

（1.河南大学第一附属医院 胸心血管外科，河南 开封 475000；2.复旦大学 附属公共卫生临床中心，上海 200540）

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。近年来，发病率在世界各国呈上升趋势，其病死率位居恶性肿瘤首位。由于HIV传播及抗生素耐药率不断上升，肺结核病在全球死灰复燃。肺结核、肺癌都属于呼吸系统疾病，具有相似的临床症状。目前，肺结核特别是菌阴肺结核与肺癌的鉴别诊断仍是一大难题。现有的鉴别诊断方法很多，但效果不一，都存在局限性。蛋白质组学技术的出现及其发展为2种疾病的诊断标志物的研究提供了新的方法及思路，未来可能为2种疾病的诊断及鉴别诊断提供新的技术手段。

1 蛋白质组学概念及研究内容

1994年澳大利亚的 Wikins和 Williams［1］在意大利提出了蛋白质组（proteome）这一概念，其意指“一种基因组所表达的全套蛋白质，即包括一种细胞、一种组织全部蛋白质”。它的最大优势是可以在同一个实验中，观察一个完整的蛋白质或蛋白质亚型在特定的时间下，生理或病理状态中所发生的相应的变化［2］。近年来，随着蛋白质组学技术的发展，已发现一批有价值的潜在标志物，为疾病的诊断和治疗开辟了新的途径［3-4］。

蛋白质组学的主要研究内容是：①表达蛋白质组学：即研究蛋白质表达质与量的变化，以及对蛋白质表达图谱的分析研究。②功能蛋白质组学：即研究蛋白质在细胞内的行为、运输以及蛋白质相互作用的网络关系。③结构蛋白质组学：为了阐述蛋白质的结构特征，而出现的一种全景式的蛋白质组学研究，可获得有机体生命活动的全景式认识。蛋白质组学的深入研究能更深入地了解疾病发生的分子机制，同时也能为疾病的预防、临床诊断及治疗提供新思路。

2 蛋白质组学常用技术

2.1 蛋白质样品制备

蛋白质样品制备至今没有一个通用的技术。在制备样品时，首先要明确实验的最终目的，然后结合实验积累的经验来选取制备方法。

蛋白质样品制备的原则：①制备的样品要全部处于溶解状态。②在制备样品时防止发生聚集、沉淀。③完全去除干扰蛋白（高丰度及无关蛋白）。④制备方法要具有可重复性。而制备蛋白质样品的同时要特别注意去除高丰度蛋白（血清蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白、珠蛋白、脂蛋白等）［5］。去除高丰度蛋白方法很多，应根据实验目的选取。例如：亲和层析技术［6］、沉淀法［7］、超滤离心法［8］、等电捕捉法［9］、液相色 谱法［10］等。而理想的去除高丰度蛋白的方法是：既能最大限度地去除高丰度蛋白又能避免影响低丰度蛋白。因此，要根据不同的实验及其目的选择不同的方法。

2.2 双向凝胶电泳（two－dimensional gel electrophoresis，2－DE）

双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的经典方法之一。1975年，O’Farrell［11］首次建立等电聚焦／SDS－聚丙烯酰胺双向凝胶电泳（IEF／SDS－PAGE）的模式，其基本原理为，第一向电泳：蛋白质在pH梯度内按照它们等电点的不同进行分离；第二向电泳：在垂直方向上按照蛋白质的相对分子质量大小进行SDSPAGE电泳分离。直到20世纪80年代中期出现了“固相pH梯度”，克服了载体两性电解质阴极漂移、梯度不稳定等缺点，从而大大提高了分辨率。但是，2－DE依然存在缺陷：①分离蛋白质数目远远小于人类基因组数所表达蛋白质。②不易分离分子量大于200KD或小于10KD的蛋白质。③不易分离疏水蛋白、膜蛋白、低丰度蛋白。④不易分离极酸或极碱蛋白。所以 “2－DE是否已过时？”也反复的被提出。迄今，许多人努力寻找替代2－DE的方法，促进了其他的蛋白质分离、分析技术的出现。例如：“液相色谱技术”在一定程度上克服了2－DE的缺陷，与2－DE比较，液相色谱技术在对分离疏水蛋白及膜蛋白等方面上具备独特的优势［12］。然而这种技术却不足以替代具有高分辨能力的、成熟技术路线的2－DE。

总的来讲，鉴于蛋白质的丰度和性质的多样性，不可能仅用一种分离技术就能应对所有的蛋白质组分析的需求。因此，多项技术互补性应用在蛋白质组学的研究中不可忽视。

2.3 质谱技术

1912年，英国物理学家Joseph John Thomson研制出第一台质谱仪。但直到20世纪40年代，质谱技术才广泛应用于有机物质的分析。20世纪80年代“四大软电技术”的出现，让质谱技术从此迈入生物质谱时代。常用的质谱技术主要有：①电喷雾质谱技术（ESI－MS）［13］：基本原理是毛细管出口处所产生的高压把毛细管流出的液体雾化成带电荷的小液滴。随着溶剂蒸发，液滴表面电荷强度越来越大，最终液滴变成带有大量一个或者多个电荷的离子，致使分析物质以电荷形式进入气相。其特点为，通过产生的高电荷离子，使质量／电荷降低到多数质量分析仪器可以检测的范围，所以ESI－MS大大提高了分析范围。②基质辅助激光解吸吸附质谱技术（MALDIMS）［14］：基本原理是将分析的物质分散在基质分子中并形成晶体。当用激光照射晶体时，由于基质分子经辐射吸收大量的能量，基质分子因能量蓄积而迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分析物膨胀并进入气相。MALDI常与TOF联合使用，而TOF可检测的分子质量没有上限，因此，MALDI－TOFMS适合对核酸、多肽、蛋白质及多糖的检测。③表面增强激光解析离子化／飞行时间质谱技术（SELDITOF－MS）：该技术是由 MALDI－TOF发展而来的，是一项蛋白芯片技术。其基本原理是待测样品与有广泛结合特性的芯片结合，然后直接进入MALDITOF的检测。它的开展解决了以往蛋白质研究中费力、耗时、不适合临床大规模筛查的弊端。

目前质谱技术已成为测定生物大分子（蛋白质、多肽、多糖等）的有效工具，也是蛋白质组学的核心技术之一［15］。

3 肺癌与肺结核的蛋白质组学研究进展

随着医学技术的发展，肺癌与肺结核的诊断及鉴别诊断无论从方法多样性或检出率上都有了很大的改观。但至今仍未找到一种快速、特异、廉价、高效的方法去鉴别两种疾病。目前只能靠多种检查来综合判定，最可靠的方法是病理组织活检及细菌学检查。然而病理组织活检创伤较大、细菌学检查时间长，检出率低等，都直接制约了两种疾病的鉴别效果，同时也阻碍了临床早期治疗。近年来，蛋白质组学的出现及发展，为两种疾病的研究提供了新的平台。从蛋白质水平揭示两种疾病的相关性及差异性，为两者的鉴别诊断研究奠定了基础。

3.1 蛋白质指纹图谱诊断模型的鉴别诊断价值

蛋白质指纹图谱诊断模型是最佳的蛋白峰组合，其检测灵敏度、特异度都要高于单一蛋白质诊断效率，具有一定的诊断及鉴别诊断价值，对肺癌及肺结核的诊断及鉴别诊断有着潜在的研究价值。王琳等［16］收集肺结核、肺癌患者及正常人的血清标本各65例，采用WCX2芯片技术对血清蛋白进行捕获，用蛋白芯片阅读器PBSⅡ对芯片进行分析比较，65例活动性肺结核与65例肺癌患者的血清蛋白质谱数据显 示：4 个 蛋 白 峰 （5335m／z、8048m／z、11700m／z、11683m／z）倾向于肺结核（P＜0.01），该诊断模型判别的总准确率为74.6% （97／130），灵敏度80.0%（52／65），特异度69.2% （45／65）。而Liu等［17］收集了87位结核病患者（51位涂片阳性、36位涂片阴性）、68位非结核病患者（55位健康人、13位其他呼吸系统疾病），用SELDI－TOF－MS分离血清蛋白质，并得到血清蛋白质的指纹图谱，最终选定9个质谱峰建立诊断模型，并对测试组检测，诊断准确率为80%；聚类分析显示：m／z 4821.45，4792.74分辨涂片阴性结核患者和对照组的准确度为81.59%。

3.2 标志物的鉴别诊断价值

标志物的检测具有快速、高效、廉价等优点，可提高临床诊断的效率，也是鉴别诊断的理想指标。利用蛋白质组学技术寻找疾病特异的标志物，可为研究疾病的早期诊断及两种疾病的鉴别诊断提供新的思路。

Liu等［18］对227例血清样品（146例肺癌、13例肺炎、28例结核性胸膜炎和40例正常人血清样品）进行蛋白质谱检测，鉴定出3个能把肺癌组与肺炎组、结核性胸膜炎组、正常人组区分开来得差异蛋白。质谱鉴定这3个差异蛋白峰分别为“野生型甲状腺运载蛋白”以及它的两个变体。Chen［19］运用蛋白组学技术对“非小细胞肺癌细胞系NCL－H266”和“脑转移细胞系 H226BR”的分泌蛋白对比研究中，发现了LDHB在非小细胞肺癌患者血清中的表达水平远远高于结核患者、肺炎患者和正常人的血清中的表达水平。林全［20］通过2－DE、MALDI－TOF－MS对癌性胸腔积液及结核性胸腔积液的差异蛋白进行了比较研究，其中有9个点仅在结核性胸腔积液表达，11个点仅在肺癌胸腔积液中表达，最终选取差异显著的10个点进行质谱分析，成功鉴定了6个蛋白质。Rodriguez－Pineiro等［21］利用2－DE和质谱技术分别从“非小细胞肺癌和肺炎病人的血清水平”、“非小细胞肺癌和肺结核病人的胸腔积液水平”进行研究，发现PEDF在非小细胞肺癌患者的血清和胸腔积液中的表达高于结核患者与肺炎患者组；而凝溶胶蛋白和金属蛋白酶抑制剂2在非小细胞肺癌的胸腔积液中表达高于结核患者胸腔积液、S100－A8和S100－A9在非小细胞肺癌的胸腔积液中处于低表达。He等［22］应用蛋白质组学方法发现了一种新的非小细胞肺癌的肿瘤抗原α－烯醇酶，并联合ELISA方法检测α－烯醇酶的自身抗体，发现α－烯醇酶在非小细胞肺癌组中自身抗体阳性率较高，为27.65%。而其他肺部疾病（包括结核病）仅在正常对照组发现了1例。

4 展望

在同一疾病不同发展阶段或不同疾病，其蛋白质表达往往存在差异，这些差异蛋白可能与该疾病的发生和发展有直接或间接的关系［23］，也可根据这些差异蛋白对疾病进行诊断及鉴别诊断［24］。目前，在蛋白组学水平上对两种疾病的鉴别诊断研究还较少。但是，不论那种疾病的特异性标志物的发现都将会对两种疾病的诊断及鉴别诊断做出巨大贡献。如今蛋白质组学已被广泛应用于各种疾病及同一疾病不同层面的研究。未来对肺癌及肺结核的鉴别诊断研究将会成为新的研究方向，也必将为两种疾病的诊断和个体化治疗提供新型技术手段。

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