AMPK与胰岛素抵抗

常洪霞，张红学

(1.哈尔滨师范大学;2.郑州大学)

1 AMPK的结构及表达

AMPK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能感知细胞能量代谢状态的改变，并通过影响细胞物质代谢的多个环节维持细胞能量供求平衡.它是一个异源三聚体蛋白，由α、β和γ 3个亚单位组成，3个亚基均为AMPK活性所必需.每个亚基都有不同的亚型，分别为 α1、α2、β1、β2、γ1、γ2和γ3.α亚单位是激酶的主要催化部位，负责将ATP的磷酸传递至目标蛋白，其含有2个功能区:N末端是催化核心部位;C末端含有一个变构结合位点参与AMP的结合，负责活性调节及与β和γ的联系.α亚单位中的数个位点(苏氨酸172、苏氨酸258、丝氨酸485等)均可被磷酸化，其中苏氨酸172位点及其磷酸化对AMPK活性的调节起重要作用.β亚单位相当于一个支架，α和γ亚单位分别镶嵌或锚在β亚单位的KIS和ASC区域，β亚单位C末端的保守结构域是形成三聚体的关键;而N末端含有N2异淀粉酶区域，称作糖原结合域，其功能可能与糖原对AMPK的调节有关.γ亚单位有4个串行重复的CBS区域，可能与AMPK连接AMP有关，但其意义目前尚不清楚.

应用免疫沉淀结合活性测定发现，α1在哺乳动物组织中分布较为广泛，α2在心脏、肝脏和骨骼肌表达较高.β2在骨骼肌中高表达，在肝脏中低表达，而β1则恰好相反.γ1和γ2广泛表达于各组织细胞，γ3仅在骨骼肌中高表达.AMPK在不同组织细胞中的这种以不同亚型复合体存在的现象，可能与组织特异性靶分子的调节有关.

2 AMPK的活性调节

2.1 运动中AMPK的激活

2.1.1 AMP/ATP比值对AMPK活性的调节

AMPK的活性主要受细胞中 AMP/ATP比值的调节.在生理情况下为了维持基本的代谢需要，细胞中维持着高浓度的ATP水平，AMP的含量很低，它们的比约为100∶1，AMPK处于无活性状态.运动时骨骼肌ATP含量减少伴随着AMP水平的升高，这是由腺苷酸激酶的作用使

2ADP←→ATP+AMP维持平衡所决定的.AMP与ATP的比值升高，启动 AMPK激酶系统.AMP激活AMPK的机制尚不明确，目前认为可能通过以下3种方式［1］:AMP通过结合到 γ亚单位2个CBS区域引起AMPK构象的改变直接激活AMPK(＜5倍);AMPK和AMP的结合使之成为其上游激酶AMPK激酶(AMPKK)的良好底物，使蛋白磷酸化酶缺乏底物(50～100倍);AMP变构激活 AMPKK，后者通过磷酸化作用激活AMPK.体外研究表明 AMP对 AMPK活性的影响可被高浓度的ATP所拮抗，说明ATP和AMP能够竞争结合AMPK的变构位点，也提示AMPK激活的关键信号是AMP的升高和ATP的降低.因此，推测细胞内AMPK活性受ATP/AMP比值调节，ATP/AMP的比值可以作为AMPK活性的标志，此比值的降低被认为是在肌肉收缩和运动过程中激活AMPK的重要因素.

2.1.2 糖原含量对AMPK活性的调节

糖原含量也是调节AMPK活性的一个重要因素，同样在AMPK激活剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)/运动刺激下，糖原含量高的骨骼肌AMPKα2的活性低于糖原含量低的骨骼肌.另外的一些研究也发现糖原的堆积能够阻断AICAR/运动刺激对AMPK活性的调节信号，表明糖原含量能够负性调节 AMPK的活性［2］.AMPK β 亚基含有糖原结合区域，但是用糖原颗粒孵育离体肌肉其AMPK活性并没有明显变化，推测糖原负调节AMPK的活性并不是两者的直接相互作用.Barnes等发现γ3亚基敲出老鼠中，糖原负性调节 AMPK活性的作用消失［3］，说明AMPK活性只有在γ3亚基存在的情况下才受糖原含量的负性调节.因此推测在运动过程中AMPK活性的稳定提高可以与糖原含量持续降低有关.

2.1.3 细胞内H+的变化对AMPK活性的调节

细胞内H+的变化也可以改变AMPK的活性，关于AMPK的体外研究发现，pH从7.3降到6.6时，AMPK的活性逐渐增高.在运动过程中，尤其是耐力性运动中组织H+浓度的增加可能参与AMPK活性的调节.

2.1.4 高能物质磷酸肌酸对AMPK活性的调节

早期的研究发现骨骼肌高能物质磷酸肌酸能变构抑制AMPK的活性，同时认为在高强度运动的起始阶段，磷酸肌酸作为能源物质参与供能，其含量的急剧降低对AMPK的激活有一定的作用.最近研究发现，尽管磷酸肌酸在骨骼肌运动中，能通过缓冲ATP含量降低的速度和减少AMP的生成速度而调节AMPK的活性，但磷酸肌酸并不能直接影响AMPK的活性［4］.

2.2 AMPK激酶的研究

如上所述AMPK的激活需要AMPK激酶，试验已经证明AMPK激酶的存在，LKB1最早发现于对Peutz-jegher综合症的研究中，被认为是抑癌基因，LKB1与另外两个称为STRAD和MO25的亚结构形成复合体，该复合体是LKB1活性所必需.LKB1可以直接磷酸化AMPK α亚单位上的苏氨酸172位(α-Thr172)而激活AMPK，这种磷酸化过程主要依靠AMP结合AMPK γ亚单位引起AMPK构象的改变使其成为LKB1的良好底物，在这个过程中LKB1的活性没有改变.

研究发现在缺少LKB1的细胞中，比如海拉细胞(在这种癌症细胞中 LKB1未表达)，α-Thr172仍可被磷酸化，AMPK活性仍可增强［5］，预示着LKB1并不是唯一存在的AMPK激酶.Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase(CaMKK)最早发现为激活CaMK的上游蛋白激酶，共有 6个亚型.Hawley等在 1995年发现CaMKK能够磷酸化AMPK，最近的一些研究发现 CaMKK 特别是 CaMKKβ(CaMKK2)亚基［6］，能够磷酸化α-Thr172而激活AMPK.CaMKK作为AMPK的上游激酶预示了Ca2+信号在肌肉运动过程中起了激活AMPK的作用.最新的研究结果显示CaMKK磷酸化和激活AMPK总是伴随着细胞内Ca2+浓度的增高，但可不伴随AMP浓度的增高，更加肯定了这一点.

2.3 AMPK的激活剂和抑制剂的研究

5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸 (5-amino-4-imidazolecarboxamide-riboside，AICAR)是腺苷的类似物，它在细胞里能转换为环腺苷-磷酸衍生物5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside(ZMP)，ZMP是AMP的类似物，具有激活 AMPK的作用.目前研究中一般应用AICAR作为AMPK激活剂，激活AMPK以研究其生物作用，但值得注意的是，AICAR是介导嘌呤生物合成的物质，同ZMP、ZDP和ZTP一样它还有其他细胞效应，并非 AMPK的特异激活剂［7］.近年来对AMPK抑制剂的研究有所进展，Davies等研究发现 Br8-AMP能够抑制AMPK活性，其机制可能是Br8-AMP与AMP竞争结合AMPK的别构位点，2mM Br8-AMP可抑制AMPK80%的活性.Zhou等最近报道了一种AMPK的抑制物质，称为复合物 C(compound C)，目前对其性质还缺乏了解.但由于特异性的原因这些抑制剂在研究中的应用也有局限性.例如，复合物C在骨骼肌中不能抑制AMPK的活性，Br8-AMP只能抑制AICAR诱导的AMPK活性增高，而对收缩诱导的AMPK活性增高没有抑制作用［8］.

3 AMPK与胰岛素敏感性

3.1 一次运动后胰岛素敏感性增加的机制研究

运动后胰岛素敏感性会增加，但其具体机制并不清楚，最近研究认为AMPK可能在运动后骨骼肌胰岛素敏感性增加过程中起着重要作用.Fisher等发现预先用AICAR孵育1小时的滑车上肌胰岛素诱导的葡萄糖转运量增加一倍［9］，并且这种作用不能被环己酰胺(蛋白质合成酶的一种抑制剂)所抑制，由此可以排除是葡萄糖转运体表增多的原因.然而在后来研究者用复合物C(AMPK的一种抑制剂)来验证AMPK在运动诱导的胰岛素敏感性增加过程中的作用的时候却没有得到相同的结论［10］，提示了此问题有待进一步研究.AICAR诱导的胰岛素敏感性增加的机制，可能是通过直接调节胰岛素信号传导过程.研究发现小鼠肝脏纯化的AMPK可以磷酸化IRS-1(胰岛素受体底物-1)的Ser789(789位点丝氨酸)［11］，用 AICAR 激活小鼠 C2C12成肌细胞和肌管AMPK发现IRS-1的789位点丝氨酸发生特异性磷酸化，提前用 AICAR孵育小鼠C2C12成肌细胞和肌管，发现胰岛素可以使与IRS-1相连的 PI3K活性增加，提示运动后AMPK可能通过磷酸化胰岛素信号传导的上游成分-IRS-1增加胰岛素敏感性.但是AICAR孵育激活AMPK导致的胰岛素诱导的PI3K活性的增加作用不依靠IRS-1的络氨酸磷酸化，并且提前用AICAR孵育成人完整的骨骼肌细胞并没有使胰岛素诱导的与IRS-1的磷酸酪氨酸相连的PI3K活性增加.由于运动后的大鼠后肢骨骼肌胰岛素诱导的胰岛素受体、IRS-1(胰岛素受体底物)的络氨酸磷酸化程度降低，以及和IRS-1相连的PI3K活性降低，认为AMPK磷酸化IRS-1的789位点丝氨酸可能在运动后胰岛素敏感性增加过程中并不起的作用.在胰岛素抵抗的小鼠中，IRS-1的789位点丝氨酸可能起着衰减胰岛素信号的作用，在肝脏中AMPK不能磷酸化ISR-1的789位点丝氨酸［12］.因此ISR-1的789位点丝氨酸在胰岛素敏感性中的作用以及AMPK磷酸化ISR-1的789位点丝氨酸的作用都需要进一步研究.

3.2 长期训练机体胰岛素敏感性提高的机制研究

长期训练也可以使机体胰岛素敏感性提高，研究发现AMPK在此过程中同样起着重要的作用，其机制是通过增加和糖转运有关的蛋白(GLUT4、己糖激酶II)的表达来提高胰岛素敏感性.Winder等发现反复AICAR刺激激活AMPK可以在观察到小鼠肌肉胰岛素诱导的葡萄糖转运增多的同时伴随着肌肉GLUT4、己糖激酶II表达增多［14］，这种效果和长期运动训练的效果相似.利用同样的方法Buhl等也发现离体肌肉胰岛素诱导的葡萄糖转运的增多［14］.关于GLUT4、己糖激酶II表达增多的机制还不清楚，有人推测:AMPK可能通过磷酸化目标转录因子开启GLUT-4基因的表达.Holmes等发现肌肉收缩激活的AMPK可促使转录因子肌细胞增强子(MEF2)和GLUT-4增强子(GEF)结合，以及钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMK)表达增强，从而增加 GLUT-4的转录［15］.相对于 GLUT4来说对AMPK诱导HK II表达增多的调控机制研究还相当少，有待进一步研究.

3.3 AMPK在胰岛素抵抗机体中的作用研究

在大量研究表明单次使用AICAR激活AMPK就可以增加肌肉葡萄糖的转运、降低血糖含量、提高胰岛素敏感性基础上，很多研究开始转向检验激活AMPK在胰岛素抵抗的机体中的作用.过度肥胖的Zucker大鼠，胰岛素不能增加葡萄糖转运，用AICAR孵育激活AMPK 90 min能抑制肝脏葡萄糖的产生，增加胰岛素诱导的葡萄糖转运［16］，同样胰岛素抵抗的高脂饲料肥胖大鼠，一次AICAR注射就能引起肝脏和肌肉的胰岛素敏感性增加(注射 AICAR 24 h后测量)［17］，这些结果显示了在胰岛素抵抗动物中药物激活AMPK起着降低血糖浓度的作用.

同样一些学者也研究了反复激活AMPK在胰岛素抵抗的机体中的效果，通过对KKAy-CETP大鼠7 d腹膜注射AICAR，发现机体血糖浓度降低(原来很高)，同时胰岛素敏感性增加［18］，然而，离体肌肉胰岛素诱导的葡萄糖转运却没有增加.通过对ob/ob大鼠7 d皮下注射AICAR发现其高血糖症消失，胰岛素敏感性增加［19］，然而和 KKAy-CETP 大鼠一样，最后一次皮下注射AICAR 24小时后分离肌肉测试，也发现胰岛素诱导的葡萄糖转运没有增加.值得注意的是，由于AICAR并非AMPK的特异性激酶，这些结果可能具有局限性，为了更好的确定AMPK是否为运动后的胰岛素敏感性增加所必须，未来的研究应该在基因敲除和转基因老鼠中进行.

4 结语

糖代谢是各种物质代谢的基础，是运动中骨骼肌的主要能量来源，AMPK作为能量代谢变化的感受器能够被运动中ATP/AMP的比值变化等因素所激活，对改善胰岛素抵抗有直接调节作用，对其信号途径的基础研究对于提高运动训练水平，更新训练理论和改进训练方法具有不可估量的作用，同时，这些问题的研究也为运动对预防和治疗以胰岛素抵抗为主要病因的2型糖尿病提供了理论依据.

［1］ Adams J，Chen Z P，Van Denderen B J，et al.Intrasteric control of AMPK via the γ1subunit AMP allosteric regulatory site.Protein Sci，2004，13:155-165.

［2］ Wojtaszewski J F，MacDonald C，Nielsen J N，et al.Regulation of 5’AMP-activated protein kinase activity and substrate utilization in exercising human skeletal muscle.Am J Physiol Endocrinol Metab，2003，284:E813 – E822.

［3］ Barnes B R，Glund S，Long Y C，et al.5’-AMP-activated protein kinase regulates skeletal muscle glycogen content and ergogenics.FASEB J，2003，19:773 – 779.

［4］ Taylor E B，Ellingson W J，Lamb J D，et al.Evidence against regulation of AMP-activated protein kinase and LKB1-STRAD-MO25activity by creatine phosphate.Am J Physiol Endocrinol Metab，2005，290:661-669.

［5］ Hawley S A，Boudeau J，Reid J L，et al.Complexes between the LKB1tumor suppressor，STRAD α/β and MO25α/β are upstream kinases in the AMP-activated protein kinase cascade.J Biol，2003，2:28.

［6］ Hawley S A，Pan D A，Mustard K J，et al.Calmodulin-dependent protein kinase kinase-beta is an alternative upstream kinase for AMP-activated protein kinase.Cell Metab，2005，2:9–19.

［7］ Young M E，Radda G K，Leighton B.Activation of glycogen phosphorylase and glycogenolysis in rat skeletal muscle by AICAR-an activator of AMP-activated protein kinase.FEBS Lett，1996，382:43-47.

［8］ Musi N，Hayashi T，Fujii N，et al.AMP-activated protein kinase activity and glucose uptake in rat skeletal muscle.Am J Physiol，2001，280:677-684.

［9］ Fisher J S，Gao J，Han D H，et al.Activation of AMP kinase enhances sensitivity of muscle glucose transport to insulin.Am J Physiol Endocrinol Metab，2002，282:E18-E23.

［10］ Al Khalili L，Krook A，Zierath J R，et al.Prior serum-and AICAR-induced AMPK activation in primary human myocytes does not lead to subsequent increase in insulin-stimulated glucose uptake.Am J Physiol Endocrinol Metab，2004 287:553-557.

［11］ Jakobsen S N，Hardie D G，Morrice N，et al.5＇-AMP-activated protein kinase phosphorylates IRS-1 on Ser-789 in mouse C2C12myotubes in response to 5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside.J Biol Chem，2001，276:46912-46916.

［12］ Qiao L，Zhande R，Jetton T L，et al.In vivo phosphorylation of insulin receptor substrate 1 at serine 789 by a novel serine kinase in insulin-resistant rodents.J Biol Chem，2002，277:26530-26539.

［14］ Holmes B F，Kurth-Kraczek E J，Winder W W.Chronic activation of 5＇-AMP-activated protein kinase increases GLUT-4，hexokinase，and glycogen in muscle.J Appl Physiol，1999，87:1990-1995.

［14］ Buhl E S，Jessen N，Schmitz O，et al.Chronic treatment with 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-D-ribofuranoside increases insulin-stimulated glucose uptake and GLUT4 translocation in rat skeletal muscles in a fiber typespecific manner.Diabetes，2001，50:12-17.

［15］ Edward O.Ojuka，Terry E.Jones，Lorraine A.Nolte，May Chen，Brian R.Wamhoff，Michael Sturek:Regulation of GLUT4 biogenesis in muscle:evidence for involvement of AMPK and Ca2+.Am J Physiol Endocrinol Metab，2002，282:E1008– E1013.

［16］ Bergeron R，Previs S F，Cline G W，et al.Effect of 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-D-ribofuranoside infusion on in vivo glucose and lipid metabolism in lean and obese Zucker rats.Diabetes，2001，50:1076-1082.

［17］ Iglesias M A，Ye J M，Frangioudakis G，et al.AICAR Administration Causes an Apparent Enhancement of Muscle and Liver Insulin Action in Insulin-Resistant High-Fat-Fed Rats.Diabetes，2002，51:2886-2894.

［18］ Fiedler m，Zierath J R，Selen G，et al.5-aminoimidazole-4-carboxy-amide-1-beta-D-ribofuranoside treatment ameliorates hyperglycemia and hyperinsulinaemia but not dyslipidaemia in KKAy-CETP mice.Diabetologia，2002，44:2180-2186.

［19］ Song X M，Fiedler M，Galuska D，et al.5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside treatment improves glucose homeostasis in insulin-resistant diabetic(ob/ob)mice.Diabetologia，2002，45:56-65.