肝毒净丸质量标准研究

于丽雅，刘海艳，李宜平

(长春中医药大学院，吉林 长春 130117)

肝毒净丸是由虎杖、紫金牛(矮地茶)、垂盆草、半枝莲、地耳草、厚朴、败酱草、紫草、贯众、片姜黄10味中药经提取、精制加工而制成的丸剂。具有清化湿热瘀毒的作用[1-2]。用于慢性乙型病毒性肝炎湿热瘀毒所致症状：肝区胀痛或刺痛，纳差，脘痞，泛恶，腹胀，腿酸乏力，口干苦黏，大便或溏或秘，小便黄等。为了较好地控制该药的质量，对方中的主要药物虎杖、厚朴、片姜黄分别进行了定性研究，对虎杖采用高效液相色谱法进行定量分析研究。

1 仪器与试药

LC-10ATvp高效液相色谱仪(日本岛津)；SPD-10Avp检测器；C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；对照品均由中国药品生物制品检定所提供；乙腈为色谱纯，水为二次重蒸水；其他试剂均为分析纯。

2 定性鉴别

2.1 虎杖薄层鉴别 取本品2 g,研碎，加甲醇15 mL，时时振摇，浸泡1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取虎杖对照药材1 g，加甲醇15 mL，同法制成对照药材溶液。再取大黄素对照品,加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述溶液各5 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-醋酸乙酯-甲醇(10∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，置氨气中熏后，斑点变为樱红色。

2.2 厚朴薄层鉴别 取本品5 g，研碎，加甲醇30 mL，超声处理(250 W，25 KHZ)20 min,滤过，滤液置水浴(70 ℃)上蒸干,残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液(临用前制备)。另取和厚朴酚对照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述溶液各5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-醋酸乙酯-甲酸(8.5∶1.5∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以2%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

2.3 片姜黄薄层鉴别 取本品2 g,研碎，加甲醇15 mL，时时振摇，浸泡1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取片姜黄对照药材3 g，加水50 mL，煎煮30 min，放冷，倾出上清液置水浴上蒸干，残渣加甲醇20 mL，超声处理(250 W，25 KHz)5 min，滤过，滤液浓缩至约2 mL，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2000年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述溶液各10 μL,分别点于同一用1%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-醋酸乙酯-甲酸(6∶3∶0.3)为展开剂，展开，取出，晾干。喷以5%香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

3 含量测定

3.1 色谱条件与系统适应性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充柱；以乙腈-水(20∶80)作为流动相；检测波长303 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL；理论塔板数按白藜芦醇苷峰计算应不低于2 000。

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液的制备 精密称取白藜芦醇苷对照品适量,加甲醇溶解制成每1 mL约含10 μg的溶液，即得。

3.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，研碎，取约0.2 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理(250 W，25 KHz)30 min,取出，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.2.3 阴性溶液的制备 按处方比例称取除虎杖以外的其余药味,按制备工艺制成缺虎杖的阴性样品，按上述供试品制备方法制成不含虎杖的阴性溶液。

3.3 方法学考察

3.3.1 线性关系考察 分别精密量取白藜芦醇苷对照品溶液6、8、10、12、14、16 μL按已拟定的色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标绘制标准曲线,进行线性回归。线性回归方程：Y=677.74X-56.227,r=0.999 9，白藜芦醇苷在0.121 2～0.323 2 μg进样量范围内呈良好的线性关系。

3.3.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，重复进样5次，依法测定，结果RSD%=0.56%，表明仪器的精密度良好。

3.3.3 稳定性试验 取同一批供试品溶液进样10 μL，分别在0、2、4、6、8 h测定，结果RSD%=0.86%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

3.3.4 重现性试验 精密称取同一批样品5分，按供试品溶液项下制备方法制备样品溶液，测定样品含量，结果RSD%=0.58%，表明该方法的重现性良好。

3.3.5 加样回收率试验 取已知含量的肝毒净丸9分，精密称定，按低、中、高质量浓度分别添加白藜芦醇苷对照品适量，按供试品溶液的制备过程制成供试品溶液，按上述色谱条件测定，平均加样回收率=98.10%，RSD%=0.98%，表明该方法的回收率良好。

3.3.6 样品测定 分别取10批样品，每批2分，按供试品溶液项下制备方法制备样品溶液，测定样品含量，结果10批样品平均含量为42.34 mg/9 g,根据上述试验结果以及参照仿制的肝毒净颗粒的质量标准，暂定本品每袋(9 g)含白藜芦醇苷不得低于32.0 mg。

4 结论

4.1 流动相的选择 选择乙腈-水(20：80)，白藜芦醇苷峰保留时间在8.2 min左右，与其他色谱峰均能达到基线分离,确定为以乙腈-水(20∶80)作为流动相。

4.2 提取溶剂的选择 按拟定的色谱条件测定，结果以甲醇作为提取溶剂时测得的含量较高。

4.3 提取时间的选择 测定结果证明，超声30 min和超声40 min测得的含量接近，故选择超声30 min。

[1]中华人民共和国药典委员会.中国药典[M].北京:化学工业出版社,2010.

[2]郑虎占,董泽宏,余靖.中药现代研究与应用[M].北京:学苑出版社,1999.